分子标签（multiplexedPCR-basedbarcodingofDNA）在NGS中有...
昌平二中分校
Illumina刚推出测序仪的时候，基本上一条lane只能测一个样本，但测序费用非常昂贵。随着通量的提高，一条lane只测一个样本显得有些浪费。后来科学家们想了一个办法，即通过在不同样本的5‘end连接上不同的几个碱基的固定标签序列，然后再添加接头序列和测序引物，PCR扩增后再上机测序。这就像给每个样本戴上了一个条码一样，测序开始先测的是固定长度的标签序列，然后再开始测目标序列。这样测序下机后就可通过生物信息学的手段根据每个样本加的标签序列的不同把每个样本区分开来。后来Hiseq2000推出来后，因为其通量大幅提高，多样本混样测序基本成了常态，于是Illumina设计了专门的index，而且会给index单独测序。 现在NGS从技术可行性、稳定性以及成本控制上都更加适应临床检验的需求。在美国，芯片和测序技术的适应症包括不明原因的生长迟缓和智力落后、先天畸形、自闭症、反复流产等的常规应用，和癫痫、多动症、肥胖、精神分裂症、先天性心脏病等疾病的致病基因研究，而且新的适应症仍在不断扩展。 然而测序错误还是存在，而且基于PCR的文库构建技术也会引入错误，在做基于ctDNA的的 超高灵敏度突变检测的时候，Sequencing error和PCR error就成了很棘手的noise。一般靶向药都是针对一些已知的基因突变设计的，ctDNA一般用基于多重PCR扩增的方式捕获需要测的目标序列，如果在血浆游离DNA两端加上随机的barcode序列，然后再进行扩增，这样每个游离DNA分子经PCR产生的错误，或者测序错误，就可根据比对到的位置和barcode序列用生物信息学的方法得到校正。比如有名的Safe-SeqS（ (i) assignment of a unique identifier (UID) to each template molecule, (ii) amplification of each uniquely tagged template molecule to create UID families, and (iii) redundant sequencing of the amplification products. PCR fragments with the same UID are con- sidered mutant (“supermutants”) only if ≥95% of them contain the identical mutation.）网络拓扑图
如果PCR错误发生在较早期的循环中，PCR错误也会被放大，在信息分析的时候，也不能忽略掉，这样的错误就成了假阳性。后来科学家们设计了各种改进方案，比如PCR采用同一模板的rolling circle amplification，比如测DNA的两条链，互相校正纠错的方案，后来还有用于单细胞测序的体外转录的方案等，很多第三方检验公司也推出了自己的ctDNA测序方案（比如贝瑞和康的cSMART）。还有很多其他厂家的ctDNA设计方案大家可在评论里讨论。
日本五节句
Barcode设计不仅仅在解决PCR error、Sequencing error和混多样品测序方面有应用，10x genomics在大规模的barcode设计上已经推出了用于组装大片段可分析结构变异的longranger、用于辅助基因组组装的supernova、用于大规模单细胞测序的cellranger等。还有很多基于barcode设计开发的很多单细胞RNA测序的应用，在此不一一举例。
逆问
其实本人最初接触barcode是2011年一个客户的RNAseq设计。他们用四碱基的随机序列加在PCR扩增前的cDNA两端，在分析的时候如果比对位置一样，方向一样（directional RNA-seq），barcode也一样的话，则认为是来自于同一模板mRNA的PCR duplication。这样去重复能更加真实地反应基因的表达情况。现在一般的RNAseq都是没有这个设计的。
2010阅兵式查了下2017年nature protocol又有一篇关于基于多barcode DNA的超高灵敏度突变检测技术（ /articles/nprot.2017.006 ）有兴趣的同学可去仔细读下这篇文章。在火车上写了此文，暂时想到的也就这些了，如果有其他barcode的应用或本文写的不正确的，欢迎大家提出讨论。稀油站
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