a. 活化酵母菌：从-70℃取出冻存的酵母菌种，划线于YPDA（无抗性）固体培养基，30℃，倒置培养2-3天； b. 挑取2mm左右大小的单菌落，接种于15ml YPDA液体培养基中，30℃，200rpm震荡培养过夜（12-14h），至OD600大于1.2；
c. 取5ul菌液接种于50ml新鲜YPDA液体培养基中，30℃，200rpm震荡培养16-18h，使OD600约为0.2-0.3； d. 室温700g离心5min，弃上清，重悬沉淀于100ml YPDA液体培养基内，30℃震荡培养3-4h，直至OD600达到0.4-0.5；
e. 转移菌液至50ml离心管内，室温离心700g，5min，弃上清；
f. 25ml无菌水悬浮细胞，700g，5min，弃上清；
g. 1ml 1×TE/ LiAc溶液重新悬浮细胞后，将悬浮物转移到2个1.5ml 离心管内，高速离心10
s，移液吸尽上清；
h. 将细胞重新悬浮于500ul 1×TE/ LiAc溶液，即酵母感受态细胞。周小青
注：酵母感受态细胞即刻用于转化，室温只可保存数小时。
2．转化Y2HGold酵母感受态细胞。
a. 1.5ml离心管中按顺序加入下列物质：
实验组 | 对照组 | 阳性对照 | 阴性对照 | 用量 |
pGBKT7-Mads | pGBKT7空载 | pGBKT7-53 | pGBKT7-Lam | 200ng |
pGADT7-T | 100ng |
变性鲑鱼精DNA | 200ug |
Y2H感受态细胞 | 100ul |
1×TE/ LiAc/PEG4000 | 500ul |
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注：鲑鱼精DNA使用前水浴煮沸20min，立即冰上冷却10min。
b. 头轻柔混合1-2min， 30℃恒温孵育30min（期间每10min颠倒混匀一次）；
c. 加入30ul DMSO（二甲基亚砜），轻柔的混合均匀，不能剧烈震荡；
d. 42℃水浴15min（每5min中取出混匀一次）后，立即置于冰上2min。高速离心10s，移液吸尽上清；
e. 1ml YPD Plus 重悬细胞，30℃，180rpm震荡培养1h；
f. 高速离心15s，弃上清，1ml 0.9%NaCl溶液重悬细胞；
e. 取100ul稀释10倍的转化混合液涂布于相应的缺陷培养基，30℃倒置培养3-5天。
注：各个转化菌株所要涂布的缺陷性培养基如下表：
转化菌株 | 缺陷培养基 | 作用 |
pGBKT7-Mads | SD/-Trp | 毒性验证 |
SD/-Trp/X-a-gal/Aba | 自激活验证 |
pGBKT7空载 | SD/-Trp | 毒性验证 |
格雷戈里pGBKT7-53 & pGADT7-T | SD/-Trp/X-a-gal/Aba ap点 | 自激活阳性对照 |
pGBKT7-Lam & pGADT7-T | SD/-Trp/X-a-gal/Aba | 自激活阴性对照 |
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Yeast Mating
1. SD/-Trp培养基上选取直径大于2mm携带pGBKT7-Mads的Y2HGold单菌落（已PCR验证），接种于50ml SD/-Trp 液体培养基，30℃，200rpm震荡培养过夜（16-18h），使OD600大于0.8；
2. 3000rpm，离心5min，弃上清，用4-5ml SD/-Trp液体培养基重悬细胞，使密度大于1×108细胞/ml；
3. 将分装的1ml油棕cDNA文库从-70℃取出，22℃水浴融化；
4. 2L锥形瓶中加入1ml油棕cDNA文库和4-5ml细胞浓度达到1×108细胞/ml的诱饵菌液；
5. 用1ml 2×YPDA液体培养基冲洗文库管壁2次，冲洗液体加入2L锥形瓶中，最后加入45ml 2×YPDA液体培养基（含50ug/ml卡纳霉素）；30℃，30-45rpm缓慢震荡20-24h；
6. 培养20h后，取出一滴菌液于载玻片上，显微镜下观察酵母形态，若细胞形态呈现“Mickey Mouse Face”则继续缓慢培养4h，直至酵母细胞形态恢复正常；
7. 将菌液转移至50ml离心管内，同时用50ml 0.5×YPDA液体培养基冲洗2L锥形瓶瓶壁2次，将2次冲洗的菌液转移至50ml离心管，3000rpm，离心10min，收集细胞，弃上清；
8. 加入10ml 0.5×YPDA液体培养基重悬细胞，记录菌体与悬浮液体积总和；
9. 从混合菌液中取100ul做1:10，1:100，1:1000，1:10000，1:100000稀释后，各取100ul稀释液涂布于SD/-Trp，SD/-Leu，SD/-Trp/-Leu固体培养基星光咏叹调上，30℃，倒置培养3-5d；
10. 将剩下的混合菌液全部均匀的涂布于SD/-Trp/-Leu/X-α-gal/Aba固体培养基上，30℃，倒置培养3-7d；
11. 3天后，观察菌落形态；菌落大于2mm圆润饱满且为蓝的即为阳性候选克隆；
12. 10ul头蘸取蓝单克隆，稀释于5ul无菌水中，将稀释的克隆打入已划分好格子的SD/-Trp/-Leu/Ade/His/X-α-gal/Aba固体培养基上，30℃，倒置培养3-5d；
13. 从SD/-Trp/-Leu/Ade/His/X-α-gal/Aba固体培养基上选取依然为蓝的克隆接种于SD/-Trp/-Leu/Ade/His液体培养基，30℃，200rpm震荡培养16-20h。
14. 保存阳性克隆菌种，提取酵母质粒，质粒PCR验证目的条带 （通用引物T7/3’AD）； 中华慈善总会会长
15. 将有目的条带的质粒转入大肠杆菌扩增，涂布于含有氨苄抗性的LB固体培养基从而筛选文库质粒；
16. 挑选单克隆于50ml LB液体培养基（含50mg/ml氨苄青霉素）扩大培养；
17. 取1ml扩培菌液送测序；
18. 在NCBI网站上进行Blastx分析。
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