二甲基亚砜、二甲基酰胺、甲醇、乙醇四种溶剂对Hela细胞培养干预效应研究 杨晓航;李舒;刘文奇;许小凡;张红;刘力
【摘 要】目的：观察二甲基亚砜（DMSO）、二甲基甲酰胺（DMF）、甲醇、乙醇四种常用有机溶剂对Hela细胞生存率的影响，为开展体外细胞干预实验研究选择溶剂种类和浓度提供参考。方法：采用MTT法检测四种溶剂各9个浓度下Hela细胞的存活率；在此基础上采用AnnexinⅤ‐FITC／PI双标记流式细胞术，观察8种不同浓度的乙醇对Hela细胞凋亡的影响。结果：四种有机溶剂不同浓度时对Hela细胞生存率产生不同影响，DMSO最佳浓度为0．5％；DMF最佳浓度0．1％，甲醇的最佳浓度0．1％～0．5％；Hela细胞的存活率和凋亡结果均表明乙醇作为有机溶媒的最佳浓度0．25％。结论：DMSO、DMF、甲醇、乙醇四种溶剂对Hela细胞活性和生存率存在负向影响，程度从小到大依次为乙醇、DMSO、DMF、甲醇，用于体外细胞培养的浓度最大均不可超过0．5％；乙醇是体外细胞培养中较为理想的溶剂，但浓度不可超过0．25％，刺激时间不可超过12h。%Objective :To research the best concentration of four kinds of organic solvents DMSO 、DMF 、methyl alcohol、ethyl alcohol effect on Hela cell through measure the optical density value (OD value) of the four sol‐vents under various survival rate .Provide guidance for select solvention microprobe and traditional Chinese medicine experiment .Methods :Using determined by MTT reagent combined enzyme standard meter method to concentra‐tions of 9 Hela survival rate .Using 8 different concentrations of ethanol and 3 time periods in Hela cells with An‐nexinⅤ‐FiTC/Pi marked ,and then characteristics on the apoptosis of Hela cells by flow cytometry method .Result :The best concentration of ethyl alcohol could not more than 0 .25% ;The bestconcentration of DMSO could not more than 0 .5% ;The best concentration of DMF could not more than 0 .1% ;The best concentration of methyl alcohol was between 0 .1% and 0 .5% .Conclusion:Ethyl alcohol is the best one of these 4 organic solvents which used in exper‐iment of Hela cell in vitro .You’d better use the concentration less than 0 .25% ;stimulate time can not more than 12 hours .if there is something wrong with the solubitity ,the order of these 4 organic solvents is ethyl alcohol ,DMSO、DMF and methyl alcohol .Take care ,the concentration must be less than 0 .5% .
【期刊名称】《陕西医学杂志》
【年(卷),期】2016(045)007
【总页数】6页(P774-779)
【关键词】H ela细胞;二甲亚砜;甲酰胺类;甲醇;乙醇;细胞培养技术;干预性研究
【作 者】杨晓航;李舒;刘文奇;许小凡;张红;刘力
【作者单位】陕西中医药大学医学技术学院 咸阳712046;陕西中医药大学医学技术学院 咸阳712046;陕西中医药大学医学技术学院 咸阳712046;陕西中医药大学医学科研实验中心;陕西中医药大学医学科研实验中心;陕西中医药大学医学科研实验中心; 陕西省中医药研究院
【正文语种】中 文
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王劲屹【中图分类】R392.1
主题词 Hela细胞 二甲亚砜 甲酰胺类 甲醇 乙醇 细胞培养技术 干预性研究
Hela细胞是体外细胞干预实验中常用的细胞株，在化学离子探针、分子作用靶向、血清药理学等研究领域使用广泛[1-4]。大量体外细胞培养的干预效应研究都涉及了有机溶剂的使
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用，但有机溶剂的使用多根据溶质需要确定浓度且差异较大 [5-7]。目前未见针对使用有机溶剂的浓度差异对活细胞计数的干预效应研究[8-10]。现有实验中细胞活性或计数的研究结果，理论上均为溶质成分(分子)与有机溶剂形成溶液体系的叠加效应，忽略了有机溶剂对细胞的干预效应，从而引起实验结果的误差。本研究拟通过观察二甲基亚砜(DMSO)、二甲基酰胺(DMF)、甲醇、乙醇四种有机溶剂对Hela细胞存活率的影响，为体外细胞实验中有机溶媒的选择和矫正相关研究结果的误差提供实验依据。
1 实验材料 宫颈癌细胞株Hela细胞，购于西安交通大学第一附属医院转化医学中心；缓冲液(PBS)配成0.01mmol/L，RPMI1640培养液购于美国Solarbio公司， 胎牛血清、胰酶购于北京全式金生物技术有限公司 ，酶标仪为美国Bio-TEK公司产品。DMSO购于美国Sigma公司(纯度>99.9%)、DMF购于广东光华科技股份有限公司(纯度>99.5%)、甲醇购于天津富宇精细化工有限公司(纯度>99.5%)、乙醇购于天津市达森化工产品有限公司(纯度>99.7%),3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二甲基四氮唑溴盐(MTT)购于美国Sigma公司。
2 细胞培养 宫颈癌细胞用RPMi1640培养液(10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、10mmol/L HEPES)，在37℃、5%CO2培养箱中培养至对数生长期，观察细胞贴壁状况良好，即可使用。
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3 MTT法检测细胞存活率 细胞经过胰酶消化后计数。调整细胞密度至1×105个/ml,分别接种于4个96孔板，每孔100μl，培养24h后分别设空白对照组、DMSO组、DMF组、甲醇组和乙醇组。空白对照组只加细胞和等体积培养基，不加有机溶剂，复孔8个；实验组分别加入DMSO、DMF、甲醇、乙醇这四种有机溶剂的9个不同浓度，分别为0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.5%、1%、5%、10%、20%，浓度单位均为体积比,每组浓度设8个复孔，孵育24h后加入MTT 50μl(终浓度是5mg/ml)，孵育4h，小心吸取上清后，每孔继续加入DMSO 150μl，孵育10min，充分震荡，放入酶标仪，在490nm处测吸光度(OD值)，重复3次。得到的实验数据，通过下面公式计算细胞相对存活率R。
4 细胞形态的观察 倒置显微镜20倍、40倍物镜下观察并记录细胞的形态变化。
5 AnnexinⅤ-FiTC/Pi双标的流式细胞术 观察8种不同浓度的乙醇对Hela细胞凋亡的影响。Hela细胞经过胰酶消化后计数。调整细胞密度至1×106个/ml,接种于6孔板，每孔2ml，培养24h后分为6h实验组、12h实验组、24h实验组。每组实验组中均包含空白对照组和8种不同乙醇浓度组。空白对照组共两个复孔，只加细胞和等体积培养基，不加有机溶剂；实验组各组分别加入8种不同浓度的乙醇，浓度分别为：0.01%、0.05%、0.1%、0.25%、0.
5%、1%、5%、10%；每组两个复孔，放入细胞培养箱进行培养，分别在6h、12h、24h时取出细胞，制成细胞悬液，经细胞晒网滤过之后，按试剂盒说明加入AnnexinⅤ-FiTC和Pi双染，流式细胞仪检测。重复3次，得到实验数据。
流浪汉与天鹅6 统计学方法 运用Graphpad prism5统计学软件，实验数据以±s)表示，采用t检验，以P< 0.05为差异有统计学意义，以P< 0.01为差异具有极显著性统计学意义。
1 DMSO对Hela细胞存活率的影响 在浓度为0.5%以内，DMSO对Hela 细胞存活率无明显影响。DMSO浓度在0.01%～0.05%时，细胞生存率与培养基对照组均无差异。但是，当浓度超出0.5%时，随着浓度的增加，存活率显著下降。以5%浓度组同0.5%浓度组相比较，细胞存活率明显下降(P<0.05)。浓度对于0.5%的各组细胞生存率明显下降，且随着浓度的升高，存活率逐渐下降，见表1。
2 DMF对Hela细胞存活率的影响 DMF的浓度为0.01%组、0.05%组、0.1%组、0.25%组、0.5%组分别与培养基对照组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，存活率与培养基对照组比无差异；DMF浓度为1%组、5%组、10%组、20%组分别与培养基对照组比较差异具有极显著统计学意义(P<0.01)，Hela细胞的存活率与培养基对照组比较有统计学差异，以0.
h场景模拟器阅读1-155%浓度组同1%浓度组相较，细胞存活率有明显下降(P<0.05)，见表2。
3 甲醇对Hela细胞存活率的影响 甲醇浓度为0.01%组、0.05%组与空白对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，Hela细胞的存活率与培养基对照组比较有统计学差异(P<0.05)，且小于培养基对照组；0.1%组和0.5%组分别与培养基对照组比较，存活率无明显统计学差异(P>0.05)；0.25%组与培养基对照组比较，存活率有统计学差异(P<0.05)，且大于培养基对照组；1%组、5%组、10%组和20%组分别与培养基对照组比较，存活率有极显著性统计学差异(P<0.01)，且随着浓度的升高存活率逐渐下降，见表3。
4 乙醇对Hela细胞存活率的影响 乙醇9种不同浓度各组分别与培养基对照组比较，差异有极显著统计学意义(P<0.01)，浓度从0.01%～0.25%，随着浓度的升高，存活率逐渐升高。0.5%组、1%组、5%组、20%组，随着浓度的增加，Hela细胞的存活率逐渐降低，而10%浓度组与5%浓度组相较，10%组Hela细胞的存活率高。以0.5%组同0.25%组相较，Hela细胞的存活率有显著下降差异有极显著统计学意义(P<0.01)。提示乙醇浓度超过0.25%时，Hela细胞的存活率明显降低，见表4。
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