新兴海洋生态毒理学模式生物——海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma) 伍辛泷;黄乾生;方超;董四君
【摘 要】海洋污染日益加剧,适用于海洋生态毒理学研究的鱼类模型的建立意义重大.海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma)在培养条件、生理和分子信息等方面的优势使其正成为海洋生态毒理学研究领域的代表性潜在模式生物.阐述了海洋青鳉鱼在海洋生态毒理学研究中的优势,系统介绍了海洋青鳉鱼在毒理学研究中的应用现状,并着重介绍了其在分子毒理学中的应用,最后对海洋青鳉鱼在海洋生态毒理学中的研究方向进行了展望. 【期刊名称】《生态毒理学报》
【年(卷),期】2012(007)004
【总页数】9页(P345-353)
【关键词】海洋青鳉鱼;海洋生态毒理学;模式生物
【作 者】伍辛泷;黄乾生;方超;董四君
【作者单位】中国科学院城市环境研究所中国科学院城市环境与健康重点实验室,厦门361021;中国科学院城市环境研究所中国科学院城市环境与健康重点实验室,厦门361021;中国科学院城市环境研究所中国科学院城市环境与健康重点实验室,厦门361021;中国科学院城市环境研究所中国科学院城市环境与健康重点实验室,厦门361021 【正文语种】中 文
长会口大桥
【中图分类】澳大利亚电影糖果X171.5
随着工业和城市化的发展，海洋污染问题日益严重［1］，加强海洋污染的生态毒理学研究具有重大的现实意义。污染物毒性的生物评价是生态毒理学研究的一种重要手段。目前已有多种广泛使用的模式生物，如四膜虫、秀丽隐杆线虫、黑腹果蝇、斑马鱼和非洲爪蟾等。物种的敏感性差异是影响毒性评价的重要因素，污染物的毒性评价需要从不同的营养水平(即初级生产者、初级消费者和捕食者)中选择合适的生物来进行研究，以确保评价的全面性。在水生态毒理学的研究中，常选择藻类(如绿藻和小球藻等)、枝角类(如大型溞和隆线溞等)和鱼类(如斑马鱼和日本青鳉鱼等)作为实验生物。斑马鱼和日本青鳉鱼已被广泛应用于淡水环境的毒理学研究中。然而，国际公认的海洋生态毒理学研究的鱼类模型还没有
建立起来。海洋青鳉鱼胚胎已被国际生命科学学会健康和环境科学研究所(HESI)认定为毒理学研究的重要工具。本文基于海洋青鳉鱼的毒理学研究最新进展，总结了海洋青鳉鱼作为海洋毒理学研究的鱼类模型的优势，系统介绍了海洋青鳉鱼在毒理学研究中的应用现状，并对其成为海洋模式鱼种进行了展望。
汤姆逊效应1 海洋青鳉鱼应用于海洋生态毒理学研究的优势
90后炫富女海水环境与淡水环境存在较大差异，这决定了污染物在海洋环境中的生态毒理学特性与淡水环境不同。由于海水盐度高，其密度、浮力、pH值、离子强度和溶解氧等指标与淡水不同。这些差异造成的影响在毒理学研究中体现在3个方面:第一，影响污染物的形态和性质，例如，海水中较高的离子强度和pH值会改变纳米材料的理化性质，进而增强纳米型二氧化钛(TiO2)的聚集率和尺寸，影响纳米TiO2在海洋生态系统中的生物有效性［2］;第二，影响污染物在水相和固相中的分配，例如，盐度的升高会导致水相中全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate，PFOS)富集于底泥中，对生存在底泥中的生物造成影响［3］;第三，影响污染物的生物富集效应。例如，太平洋牡蛎中的PFOS浓度在35‰盐度比在10‰盐度时高1.7～2.7倍［4］。这些差异说明了淡水生态毒理学的研究结果不能直接用于
评估海水环境中的毒性效应。但目前水生毒理方面的研究大都基于淡水环境条件，海水生态毒理学研究亟需加强。
斑马鱼(Danio rerio)、黑头呆鱼(Pimephales promelas)、食蚊鱼(Gambusia affinis)、孔雀鱼(Poecilia reticulata)和日本青鳉(Oryzias latipes)，在国际上已成为公认的淡水生态毒理学研究模型。与淡水鱼模型相比，海水鱼模型的研究非常滞后。虽然淡水/河口物种(如羊头小鱼(Cyprinodon variegatus )和底鳉(Fundulus heteroclitus))也适用于海洋环境的生态毒理学研究。不过，它们的缺点也很明显。一方面，种内个体间生长速率差异大，个体差异显著;另一方面，这2个物种的基因信息较贫乏，较难开展分子毒理学研究。
我行我海洋青鳉鱼(Oryzias melastigma或Oryzias dancena)，又名黑点青鳉、海水青鳉和印度马达卡(Indian medaka)，原产于巴基斯坦、印度、缅甸和泰国沿海及淡水水域。在分类学上，海洋青鳉鱼与日本青鳉同属脊索动物门辐鳍鱼纲颚针鱼目怪颌鳉科青鳉属。青鳉属作为模式物种，与斑马鱼相比，具有以下特点(表1)［5］:(1)温度适应范围较广，方便构建温度敏感性的突变种;(2)盐度适应范围较宽，各物种可分别适应不同的盐度环境;(3)可充分利用同属近缘物种进行比较生物学研究，这与果蝇相似，果蝇属的多个物种的基因组分析大大促进了比较生物学的研究。
海洋青鳉鱼作为毒理学研究模型，具有青鳉属物种所共有的优势［6］:(1)体型较小(4.5～23 mm)，对环境的耐受力较强，容易在实验室条件下进行大规模饲养;(2)性别差异可通过鱼鳍形态的不同而快速辨别，且雌鱼产卵量大，世代周期短(2～3个月);(3)鱼卵体积较大，颜透明且不易破损，发育各阶段变化明显，极易进行各种实验观察和操作;(4)鱼卵和幼体对环境中各类污染物的干预敏感，只要到对污染物响应的特定敏感基因或其他分子水平上的变化，就可快速反映环境污染状况。此外，海洋青鳉鱼在青鳉属中拥有其独特的优势——对盐度的适应范围非常广，可在0‰～35‰的盐度范围内生存。虽然日本青鳉在一定程度上也可适应各种盐度环境，但其适应能力无法与海洋青鳉鱼比拟(表2)。在基因信息方面，日本青鳉全基因组序列已经解析，而海洋青鳉鱼与日本青鳉在系统发育上非常相近，因此海洋青鳉鱼基因信息也可很方便地获得，目前已开发出相关基因芯片［7］。此外，针对日本青鳉的解剖学和生理学等方面的研究已比较完善和系统，这为海洋青鳉鱼的相关研究提供了参考便利。这些优点使海洋青鳉鱼有潜力成为海水生态毒理学研究的模式生物［5，8-9］。
表1 青鳉鱼与斑马鱼特征的比较［5］Table 1 Comparison of features between medaka and zebrafish特征 斑马鱼 青鳉鱼代时 8～12周 8～12周性别决定 无主要基因 XX－XY绒毛
膜 软 硬孵化周期 2～3 d 7～10 d产卵能力 100～200卵/周 10～30卵/d染体数目 25对 24对基因组规模 1 700 Mbp 800 Mbp胚胎干细胞 不可获得 可获得转基因技术 成熟 成熟精子存储 建立 成熟卵母细胞培养 未建立 建立
表2 海洋青鳉鱼与日本青鳉鱼在海水中生存能力的比较［6］Table 2 Comparison of survival ability in seawater lastigma and O.latipes适应指标 日本青鳉鱼 海洋青鳉鱼对海水的瞬时适应性 无 很好对海水的慢性适应性 很好 很好在海水中雄鱼精子的活力 弱 很强在海水中的产卵能力 很强 很强鱼卵在海水中的受精能力 强 很强胚胎在海水中的发育情况 好 很好胚胎在海水中的孵化情况 很好 好
2 海洋青鳉鱼在毒理学研究中的应用
2.1 海洋青鳉鱼的分子生物学研究基础
海洋青鳉鱼的分子生物学基础数据正逐步完备。目前已鉴定了一批器官特异性表达分子标记物(涉及脑部、眼部、心脏、胸鳍、胰腺、肝脏、肌肉和神经等器官和系统)(见表3)。器官特异性分子标志物用于指示特异器官的发育状况，其表达异常可指示污染物的器官发育
毒性。Chen等［8］采用原位杂交法分析了11个器官特异表达基因在胚胎发育期各阶段的表达情况。这11个基因包括了前脑(distal－less homeobox 2，dlx2)、中脑(orthodenticle homeobox 2，otx2)、视网膜(retinal homeobox protein 2，rx2)、中后脑边界(engrailed 2，eng2)、后脑(early growth response 2，krox-20)、肝脏早期分化(hematopoietically expressed homeobox，hhex)、神经(sonic hedgehog-like protein，ssh)、肌肉(myosin heavy chain，MYHL2)、肠(intestinal peptide transporter，IPT)、脑皮质(zinc finger protein 462，ZFP462)和体细胞(ubiquitin specific peptidase 2，USP2)等相对应的标记基因，其中前8个基因在胚胎发育期各阶段的表达情况与斑马鱼和日本青鳉鱼类似。
除器官发育特异基因外，一些功能调节基因也已获得解析。缺氧相关的基因:缺氧诱导因子-1 (hypoxia-inducible factor 1，HIF1)、端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)、瘦蛋白受体(leptin receptor，LepR)［11-12］、卵壳前体蛋白基因(choriogenin H，Chg H;choriogenin L，Chg L)［13］、动蛋白超级家族-7基因(kinesin superfamily 7，KIF7)［14］、钠/钾-ATP酶基因(Na+/K+-ATPase，NKA)［15］和钠、钾、二氯-协同转运蛋白基因(Na+，K+，2Cl－cotransporter，NKCC)［16］;心血管发育相关基因:骨形态发生蛋白-4(bone morphogenetic protein，BMP4)、GATA连接蛋白-4(GA
TA-binding protein 4，GATA4)、NK2转录相关因子-5(NK2 transcription factor related 5，NK2.5)、成纤维细胞生长因子-8(fibroblast growth factor 8，FGF8)和环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX2)等基因［17］;以及2个铁调素基因(hepcidin 1，HEP1;hepcidin 2，HEP2)［18］的cDNA已在海洋青鳉鱼上完成克隆(表3)。环境激素诱导的相关基因，包括受体类:雌激素受体(estrogen receptor，ER)、芳烃类受体(aryl hydrocarbon receptor，AHR)、过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator-activated receptor，PPAR)、卵黄蛋白原(vitellogenin，VTG)和细胞素P450酶系(cytochrome P450 1A，CYP1A)等在环境激素类污染下的表达模式已有报道［19］。这些敏感基因可作为环境胁迫的指示因子。海洋青鳉鱼在缺氧(溶解氧为(1.8±0.2)mg·L-1)条件下生存3个月后，肝脏中TERT的转录与翻译、细胞增殖和凋亡水平都发生了显著改变［9］。缺氧可上调海洋青鳉鱼肝脏和睾丸组织中TERT的表达，而这种上调是通过缺氧诱导因子-1介导的［12］。瘦蛋白受体基因的表达受到缺氧的影响，并表现出组织特异性，有望成为一种灵敏的标记基因［11］。
江汉大学实验师范学院
蛋白的表达量检测通常需要相应的抗体。由于同源蛋白的保守性，抗体在近缘物种间有一定的通用性。而斑马鱼的抗体库已较为完善，因而可直接利用斑马鱼的抗体库进行筛选，
获取对海洋青鳉鱼相应同源蛋白具有特异反应的抗体，省去较为繁琐的抗体制备过程。通过全胚胎免疫组化法筛选，17种斑马鱼抗体(α-tubulin、β-tubulin、β-catenin、HuC/ HuD、Islet-1、SV2、HNK-1、Zn-12、TH、Znf-1、Zpr-1、Zpr-3、MF20、CH1、4D9、H3和EMA-1)可与海洋青鳉鱼发生特异性的免疫反应［8，10］。这些抗体与神经、心脏和脑部等器官的发育关系密切，为蛋白水平的毒性研究提供了基础。另外，小鼠抗人TERT单克隆抗体mAb476可特异性地与海洋青鳉鱼TERT蛋白结合，TERT蛋白在各组织中的细胞质和细胞核区的表达用蛋白质印迹法(Western blotting)得以定量［9］。在氧化锌纳米颗粒对海洋青鳉鱼的毒性研究中，用Western blotting检测了金属硫蛋白(metallothionein，MT)，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和热休克蛋白-70(heat shock protein 70，HSP70)的表达量，并证实SOD的蛋白表达随着纳米氧化锌的浓度升高而增加［20］。与蛋白质印迹法相比，免疫组化可直观了解蛋白的组织分布情况(表4)。Kong等［9］利用对成鱼切片后的免疫组化的方法，观察了海洋青鳉鱼的TERT蛋白在睾丸、卵巢、肌肉、脑、鳃、肠、肾和肝等器官的表达情况。增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)是反映细胞增殖的标记蛋白，利用免疫组化的方法可检测细胞的增殖情况。实验表明，PCNA的结果与TERT在转录和翻译水平的表达呈现出显著的相关性［9］。PCNA检测也可反映海洋青鳉鱼胚胎发育的时空特性［10］。
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