袁将;姬瑞芳;全庆华;王加利;郭晓宇;张伽妹;谭鹏;韩静;刘永刚
【摘 要】Harmine is one of β-carboline alkaloid that significantly inhibits the multivulva phenotype of let-60(n1046gf), a worm called Caenorhabditis elegans.Therefore, harmine has an important potential application in pancreatic cancer.Metabolic research in vivo is one of the important ways of pharmacodynamic substance research, which can illuminate the existent form medicine in vivo and confirm the real active constituent of medicine.The fragmentation pathway of harmine was analyzed by ultra performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF MS), and the possible fragmentation pathways and characteristic fragment ions were determined.The metabolites of harmane in Caenorhabditis elegans were studied by UPLC-Q-TOF MS.The MRM data acquisition model was used to study the content of harmine in the nematode worms at different time after administration by the semi-quantitative analysis.The results show that the fragment pathways of harmine are mainly
RDA cleavage, including the loss of methyl groups and hydroxyl groups, and the cracking of indole ring.The metabolites of demethylated (m/z 199) and hydroxylated (m/z 229) of harmine (m/z 213) were detected in positive ion mode.The results of semi-quantitative study show that the metabolism of nematodes is strong in 0-5 h, and the content of harmine is decreased by about 80%, the metabolism rate slows down after 5 h.The study can lay the foundation for the development of new drugs for the treatment of pancreatic cancer.%去氢骆驼蓬碱是一种β-咔啉类生物碱,能够显著地抑制秀丽隐杆线虫let-60(n1046gf)的多产卵器表型,具有胰腺癌的潜在能力.本研究采用超高效液相谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)法分析去氢骆驼蓬碱,确定其可能的裂解途径及特征碎片离子,同时研究其单体在线虫体内的代谢产物,并对给药后不同时间点的线虫成虫体内去氢骆驼蓬碱的含量进行半定量分析.结果显示,去氢骆驼蓬碱的裂解途径主要为RDA裂解,包括甲基、羟基等基团的丢失以及吲哚环的开裂.在电喷雾正离子模式下,检测到去氢骆驼蓬碱(m/z 213)的去甲基化(m/z 199)、羟基化(m/z 229)的代谢产物.半定量分析结果表明:0～5 h,线虫代谢旺盛,线虫体内去氢骆驼蓬碱的含量下降约80%;5 h后,代谢速率减慢.该方法适用于去氢骆驼蓬碱在线虫体内代谢产物的研究,能够为去氢骆驼蓬碱胰腺癌的新药研发提供数据支持.
【期刊名称】《质谱学报》
【年(卷),期】2017(038)004
【总页数】8页(P478-485)
【关键词】去氢骆驼蓬碱;秀丽隐杆线虫;代谢;裂解机制;超高效液相谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)
【作 者】袁将;姬瑞芳;全庆华;王加利;郭晓宇;张伽妹;谭鹏;韩静;刘永刚
【作者单位】皮托管北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102;北京中医药大学,北京 100102宁夏师范学院学报
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.63
去氢骆驼蓬碱(harmine)，又称肉叶芸香碱，是一种β-咔啉类生物碱，其基本母核是由吲哚和吡啶骈和而成的，主要来源于多年生草本蒺藜科骆驼蓬(Peganumharmala L.)，在植物、海洋生物、昆虫、哺乳动物、人体组织、体液中也有分布。去氢骆驼蓬碱的药理作用广泛，包括抗菌、抗疟原虫、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗诱变、致幻等，对消化道肿瘤的效果显著[1-4]。由于去氢骆驼蓬碱较好的抗肿瘤活性，许多学者对其结构进行了修饰，发现9位N原子上的氢被苯丙基、苄基等取代时，其抗肿瘤活性显著增强，IC50值在10 μmol/L以下时，应用前景广泛[5-6]。
秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)，以下简称“线虫”，属于线形动物门线虫纲动物，具有结构简单、生命周期短、身体透明、易于镜下观察、遗传背景清楚、体型细小、易于高通量筛选、造模简单等特点，在代谢综合征疾病(如糖尿病、衰老、脂肪代谢疾病等)和神经退行性疾病(如阿兹海默病、帕金森疾病、亨廷顿舞蹈症等)的药物筛选、药物新靶点的发现和证实、药物作用机制、化学基因组学和毒理学研究中应用广泛[7-8]。许多哺乳细胞中的信号通路，如Wnt、Notch和Ras三条信号通路，在线虫体内是非常保守的。其中，Ras/MAPK信号通路在哺乳细胞中控制着细胞的分裂，而在线虫中控制线虫产卵器的形成，当这条通路上的基因发生突变时，如突变频率较高的ras基因(翻译产生Ras蛋白，在线 虫中的同源蛋白是Let-60)，线虫将会形成除正常产卵器外的多个假产卵器，let-60(n1046gf)线虫株就是根据此突变构建的模型[9]。利用let-60(n1046gf)线虫株筛选Ras蛋白的抑制剂-抗肿瘤药物时，产卵器的个数成为判定筛选结果的依据，当药物有效时，线虫会形成一个正常的产卵器，恢复为野生型。线虫身体结构简单，有完善的神经系统和肌肉系统，但没有肝脏等器官，能否像哺乳动物一样代谢药物有待进一步研究。近年来研究发现，线虫体内含有多种酶，比如精氨酸酶[10](代谢精氨酸和部分含氮化合物，如尿素、甲酰胺等)、壳多糖酶[11](线虫中有其同源蛋白)、乙醛脱氢酶[12](能够抑制氧化应激)、细胞素P450酶[13](能够代谢内源性和外源性物质)、乙醇脱氢酶[14]等代谢酶，为药物的体内代谢研究提供了可能。
给自己点一盏灯>《中华人民共和国突发事件应对法》
本课题组前期研究表明，去氢骆驼蓬碱能够有效地抑制let-60(n1046gf)线虫多产卵器株表型，并且呈现剂量依赖性，浓度为80 μmol/L时的抑制率接近90%，但是去氢骆驼蓬碱能否在线虫体内发生代谢有待研究。基于此，本研究将采用超高效液相谱-四极杆-飞行时间质谱(UPLC-Q-TOF MS)联用技术分析去氢骆驼蓬碱在线虫体内的代谢产物，并考察代谢速率，丰富完善其在电喷雾正离子模式下的质谱裂解规律，为去氢骆驼蓬碱乃至于β-咔啉类生物碱的研究和线虫在中药筛选中的应用奠定基础。
ACQUITY 超高效液相谱仪：美国Waters公司产品；DH3600电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司产品；体式显微镜：上海普丹光学仪器生产公司产品；去氢骆驼蓬碱：纯度>98%，实验室自制；1-乙基吲哚-3-甲酸：纯度>98%，实验室自制；let-60(n1046gf)线虫株：美国Caenorhabditis Genetics Center(CGC)产品；NGM培养基、M9溶液：实验室配制；甲酸、乙腈：均为质谱级，美国Fisher公司产品；蒸馏水：屈臣氏公司产品；其他试剂均为分析纯。 用二甲亚砜(DMSO)将去氢骆驼蓬碱配制成50 mmol/L溶液，按照文献[15]的方法，另外加入去氢骆驼蓬碱溶液(加药组)或DMSO(对照组)，配制成每板含80 μmol/L去氢骆驼蓬碱或DMSO的培养基，备用。
挑取let-60(n1046gf)线虫株成虫置于配制好的22 ℃ NGM培养基中产卵2 h，然后将成虫挑走，加入含有80 μmol/L去氢骆驼蓬碱或DMSO的OP50大肠杆菌作为食物，置于22 ℃生化培养箱中培养至成虫。用M9溶液将线虫成虫从培养基中洗下，收集在EP管中，置于培养箱中饥饿，分别在0、2、4、6、8、10、16 h时将其取出；以4 000 r/min离心2 min，沉淀部分用甲醇-水混合溶液(3∶1，V/V)振摇清洗3次，每次10 min，除去线虫体表的杂质；然
后用300 μL混合溶液将沉淀部分重新混悬，用研磨器充分研磨，将研磨液以13 000 r/min高速离心15 min；取200 μL上述样品与5 μL内标溶液混合(0.01 g/L甲醇)，漩涡振荡1 min，吸取上清液，进行液相谱-质谱分析。
管妖妖的风花雪月>甲基橙
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议