10亲和层析纯化胰酶

实验14 亲和层析纯化胰酶

一、原理

在制备胰蛋白酶过程中，往往混杂着与胰蛋白酶相近似的蛋白水解酶，如胰凝乳蛋白酶和弹性蛋白酶。由于三者在物理化学性质和结构上均十分接近，利用一般常用的提取分离方法，很难将它们之间彼此彻底分开。为了获得高纯度的胰蛋白酶制品，采用亲和层析技术进一步纯化后、可达到十分满意的效果。

生物大分子化合物的重要特征之一是具有与某些相对应的分子通过次级键或共价键专一结合的能力即亲和力。例如酶与抑制剂之间，抗原与抗体之间，结合的双方不仅是专一的，而且结合以后可以在不丧失生物活性的基础上用物理或化学的方法进行解离。根据这一特性，如果把具有亲和力的一对分子的某一方连接于水不溶的固相载体上作为固定相，那么另一方随着流动相流经该固定相时，双方便亲和结合为一个整体。然后只有改变某种物理条件或化学条件使结合的双方解离，即能得到与固定相有特异亲和力的某一特定物质。这种利用生物分子和相对应分子之间亲和结合和解离性质而建立起来的层析方法称之为亲和层析。

亲和层析作为一种新型的分离纯化技术，可以用来纯化各种酶、抗体、抗原、维生素结合、传递蛋白、激素和药物的受体、核酸以及其他生物大分子化合物。与一般的提纯生物大分子化合物的方法相比，亲和层析具有简单、快速、得率和纯化倍数高等显著特点，尤其适合实验室规模的微量生物大分子化合物的分离纯化。但是，亲和层析也有其局限性。由于某一种生物大分子化合物只与特定的配基之间具有亲和力，因此针对每一个分离对象不仅需要寻和制备专一的固相配基，而且还需要选择特定的层析条件。几乎没有统一的方法可供任意配套。

排放因子用于生物活性分子固相化的材料首先要求能够功能化，即具有能活化或修饰的功能基团，以使配基与之结合，除此之外，固相化材料必须具有稳定的物理化学性质，优良的流通性，非专一性吸附小等特性。常用的固相载体有纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和交联琼脂糖等。

为了将配基偶联与固相载体上，需要使固相载体活化，即使载体具有与配基进行反应，生成共价偶联物的性质，其方法根据固相载体的性质而定。琼脂糖、葡聚糖或纤维素活化最常用的方法是溴化氰法，此外，也可以用均二氯三嗪或三氯三嗪、高碘酸盐、环氧乙烷等方法。活化了的固相载体与配基偶联，便可得到亲和吸附剂。

适合亲和层析法来分离纯化的物质和他们的配基有

被分离物	其固相配基
酶	底物类似物抑制剂辅助因子
抗体	抗原病毒细胞
凝集素	多糖糖蛋白细胞表面受体细胞
核酸	透明的距离互补碱基序列组蛋白核酸聚合酶结合蛋白
激素	维生素受体载体蛋白
细胞	细胞表面专一性蛋白凝集素

本实验将胰蛋白酶抑制剂－鸡卵粘蛋白与Sepharose 4B偶联为亲和层析拄，用以提纯胰蛋白酶。通过实验学习和掌握蛋白质的亲和层析原理与技术。

二、材料与试剂

1．材料

①Sepharose 4B的活化和偶联：

Sepharose 4B 7 ml、1.5 M Na2CO3 250 ml、0.1 M NaHCO3（含0.5 M NaCl）pH 8.5 1000 ml、0.1 M HCl－Gly pH 2.8 100 ml、0.2 N 甲酸 250 ml、0.2 M Tris－HCl pH 7.5 500 ml、0.1 M Tris－HCl pH 7.5,（含0.5 M KCl,0.05 M CaCl2）500 ml、0.1 N 甲酸钾－0.5 N Kcl pH 2.5 500 ml、0.1 N Na2CO3－NaHCO3 pH 9.5 100 ml

②亲和层析

0.1 M Tris－HCl pH 7.5（含0.5 M KCl,0.05 M CaCl2）200 ml、粗胰蛋白酶液约50 ml、0.1 N甲酸钾－0.5 M KCl pH 2.5 100 ml

2．仪器器材

抽滤瓶500－1000 ml、层析拄、紫外分光光度计、紫外蛋白监测仪、烧结漏斗、移液器、磁力搅拌器

三、实验步骤：

1．鸡卵粘蛋白的制备（见实验8）

2．Sephadex-G75的活化及偶联

⑴2.5g干重的葡聚糖凝胶SephadexG-75溶胀洗涤数次，缓慢搅拌

⑵加入0.05M Na104溶液50ml,30min活化凝胶

⑶蒸馏水洗涤3次，抽干备用

⑷取纯化的鸡卵粘蛋白87.5mg，溶于35nml水

⑸加入活化葡聚糖凝胶、5%K2CO3、调pH7.5-9.0,缓慢搅拌3h,随时检查pH值，加5% K2CO3以保持pH的稳定

⑹ 0.27 gKBH4溶于20ml水，缓慢搅拌加入上述体系，反应5h,其间pH维持在6.5-7.5间，缓慢加盐酸调节

3．胰蛋白酶的亲和层析

⑴将鸡卵粘蛋白…Sephadex-G75 装柱，用pH7.5, 0.1 M含0.5 M KCL，O.O5 M CaCL2的缓冲液平衡，平衡约2～3倍的柱体积

⑵将粗胰酶液上样柱层析。用紫外蛋白监测仪280 nm处监测蛋白吸收峰，（随着上柱和流出的杂蛋白量的平衡，吸收峰达到稳定，一旦上柱的胰蛋白酶量超过柱的负荷时，则胰蛋白酶溢出，使吸收峰升高，此时应停止样品上样，改用pH 7.5的平衡缓冲液洗出杂蛋白，待洗出液的吸收回到基线后，改用0.1 N的甲酸钾0.5 M KCL，pH 2.5的洗脱液解吸，）柱的流速维持在1.5 ml /min左右

⑶收集洗脱下来的蛋白峰蛋白，测总蛋白量及比活性，并根据上柱样品的总蛋白量和比活性计算经亲和层析后胰蛋白酶比活性提高的倍数，总蛋白回收率，胰蛋白酶量。

⑷当胰蛋白酶峰洗出，待紫外吸收回到基线后，重新用缓冲液平衡，亲和层析柱可以反复使用。

四、实验结果：

1．蛋白

蛋白	1	2	3	4	5	6	7	8
OD值	0.042	0.017	0.197	0.063	0.169	0.319	0.182	0.141

蛋白	9	10	11	12	13	14	15
OD值	0	0	0	0.011	0.035	0.015	0

2．酶活

沈阳大学李曼

mepg 蛋白	1	2	3	4	5	6	7	8
OD值	0.20	0.08	0.02	0.02	0.16	0.06	0.13	0.13

上海振华港机

蛋白	9	10	11	12	13	14	15
OD值	0.25	0.17	0.03	0.02	0.03	0.02	0.02
						凤凰社会

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本文发布于:2024-09-20 18:29:34，感谢您对本站的认可！

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