自俄国植物学家Tswett创立谱法以来，已有近100年的历史.1903年Tswett在华沙自然科学协会提出论述吸附谱的论文，详尽的研究了叶绿素在100多种吸附剂上的吸附现象，提出了谱法的概念，虽然他所用的方法分离效率不高，分离速度缓慢，一次分离需要儿小时甚至几天的时间，但一直到20世纪40年代中期，仍然是人们所采用的惟一的一种谱方法.
20世纪40年代到50年代初，先后出现了纸谱法( Paper Chromatography, PC)和薄层谱法( thin-layer chromatography,TLC).这两种方法的特点是简单，分离时间短，用样量也比经典的柱潜法少得多.
1952年，James和Martin提出了气相谱法( gas chrnmatography, GC ).使谱法的发展大大前进了一步.由于应用面广泛而受到人们的重视.特别是20世纪60年代初Giddings等人对谱理论的研究成果，为高效液相谱的发展奠定了理论基础. 虽然气相谱的应用领域十分广泛，但仍不能解决大量的挥发性差和热不稳定的化合物的分离难题，经典的液相谱仍然是用于分析这类化合物的手段.直到20世纪60年代后期由于新型柱填料、高压输液泵和高灵敏度检测器的出现，才使液相谱快速地发展起来，并发展成为高效液相谱( high performance liquid chromatography, HPLC). 高效液相谱发展现状及前景2011-12-09 中国化工仪器网点击：379液相谱分析是指流动相为液体的谱技术，是谱法中最古老的一种，但通过改进填料的粒度及柱压，在经典的液相柱谱的基础上引 入了气相谱的塔板理论，在技术上采用了高压输液泵，高效固定相和高灵敏度的检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种谱技术被称为高效液相谱法(HighperformanceliquidchromatographyHPLC)。中药的成分非常复杂，以往常用的薄层谱等方法因其精密度、准确度、灵敏度、重现性差而不能满足现代中药的需要。高效液相谱正是以其稳定、可靠、高效的特点成为中药研究的最重要的分析方法。目前高效液相谱已经广泛应用于生物碱、皂苷、黄酮、蒽醌、香豆素等各种中药有效成分的测定。近年来对高效液相谱监测中药的研究非常多，由于高效液相谱集经典液相谱和气相谱的优势于一身，无论柱效、选择性还是分析程度都达到或超过了它们，近年来对高效液相谱的不足之处进行了改进，使这项技术日臻完善。
1高效液相谱发展近况
高效液相谱在药物分析中的应用，主要考虑试样的预处理和分析柱、检测器的选择。在试样的预处理上，日前兴起的固相(微)萃取使得许多含量低的成分得到精制提纯，从而适于高效液相谱的测定，而孙新国采用逆流萃取测定川芎嗪含量取得了很好的效果。中药中有些紫外吸收弱，或无特征紫外吸收的成分，直接用高效液相谱测定，其灵敏度和分离度都不尽人意，利用柱前或柱后衍生化法可使这些成分较精确地测定出来。对于极性大、脂溶性差物质，在YWGCl8柱上不易保留，用十二烷基磺酸钠作为离子对试剂，降低其极性，延长柱上的保留时间，取得较好的分离较果。将液相谱和质谱这两个强有力的分析技术在线连接在一起，经过三十年的发展已成为一项较为成熟的分析手段，但是
它从形成伊始就存在着问题：从液相谱流进质谱时，流动相的变化、溶剂的组成、高温高压离子化的问题制约着这种联用技术发展，大气压离子化接口具有去除溶剂和离子化的双重功效，它的引入，使得该技术在各个领域得到了广泛的应用。电喷雾离子源是一种软电离技术，一般只生成(M H) 和(M-H)-两种分子离子峰，选择性监测(mz)190的负分子离子峰，具有较高的灵敏度、准确度、专一性，满足了低浓度药物研究的需求。由张莉等人研究的三维高效液相谱法可以同步测定葛根素和阿魏酸两种指标。通过实验证明：如果选择合适的柱温等谱条件，乙醇作为反相高效液相谱流动相，分析中药及中成药中有效成分，既安全又准确。结构相似的物质，普通的检测器难以检测出来，高效液相谱-电化学法可以有效地测定黄连粉中仅差一个基团的黄芩苷和黄芩素的含
量。样品经谱柱分离后收集，再经荧光分光光度计测荧光强度，影响因素多，测定复杂，改进后的高效液相谱-荧光法则可以不经衍生化和收集分离物，只经化学处理除杂，浓缩后直接进样即可。用该法测定贯叶连翘中金丝桃素的含量也取得了较好的结果。高效液相谱-示差折光测黄芪精口服液中黄芪甲苷的含量也都取得了较为满意的结果。对于只有紫外末端吸收，用紫外检测时灵敏度低，基线易漂移，示差折光检测其易受外界条件干扰，蒸发散射检测器能克服以上不足，响应值只与样品质量有关，其信号相应与质量成正比，不同化合物，质量相同则信号相应基本一致。蒸发光散射检测法是基于不挥发样品分子对光的散射程度与其质量成正比，与其所含基团性质无关。只要选择适当的检测器参数，便可使流动相和溶剂完全气化，不产生信号，而样品中的各个组分以不挥发粒子存在，对光
有散射，以被检测出来。因此，蒸发光散射检测器可用于含不同基团的多组分同时分离、分析。和紫外、荧光等方法相比，蒸发光散射检测法对不同物质有近似相同的响应因子,
因而不出现低浓度、高响应或高浓度、低响应的现象，有利于不同比例混合物的准确测定.高效液相谱-蒸发光散射检验法测定银杏叶中萜类内酯含量、红参及育精胶囊中人参
皂苷Rg1和Re的含量和藤黄中藤黄酸含量都得到了很好的结果。
2高效液相谱的研究动向
2.1缩短分析时间，提高分离效率。应用先进的检测仪器和方法，对流动相、固定相进行调节或改变，采用梯度洗脱、柱切换技术有望解决这个问题。梯度洗脱的高效液相谱法，能分析较宽极性范围的样品，较等度洗脱具有很大的优势，但对于成分更复杂、极性范围更宽的中药样品则有些力不从心。多柱高效液相谱法又称多维高效液相谱法。除具有梯度洗脱一样的改变流动相浓度的优点外，还可以改变固定相种类、键合度、粒径、柱长、柱径等及流动相种类、浓度等。
2.2进一步向自动化、智能化及联用技术上发展。液相谱与质谱联用在国外已成为测定低浓度生物药品中药物及代谢物的首选方法,LC-MS-MS法测定血浆中HIV-1蛋白酶，准确高效，血浆中残留的内源性组份和其他药物不干扰测定，既节省材料又节约时间。已经应用于体液、血浆、血清中的药物分析。
中药复方注射液“清开灵”中的胆酸类物的分析采用液相谱质谱质谱联用，效果理想。高效液相谱-核磁共振联用在药物分析方面的作用很不错。新近提出的智能多柱高效液相谱系统利用切换技术的模块式分离性能，把样品分块的切换进不同性质的谱柱，再用合适的流动相洗脱。全过程采用智能化控制。
3高效液相谱在中药分析中的应用前景
中药研究的大趋势是全成分分析，通过对从单味药到复方的不同配伍、煎煮时间等的研究，才能发现中药中化学成分的变化规律，到中药机理之间的有机联系。中药成分繁多，且各种成分的性质遍布所有极性段、酸碱范围。实现多成分分析的最简单途径即在一根足够长的谱柱上，采用温和的流动相，在足够久的时间内洗脱。但这与现代分析要求的简便快速相违。通过大量的应用研究表明，高效毛细管电泳在分析中药成分，尤其在分析高极性化学成分方面有较大优势，在分析大量的复方制剂方面显示了较高的能力。由于毛细管几乎不会出现高效液相谱分析中常出现的柱床污染现象，而且用过的毛细管柱只需很短的时间进行冲洗后，即可以进行第二个样品的分析，快速高效且分辨率很高。新兴的毛细管电谱是集高效液相
谱和毛细管电泳优势于一身的一种新型电分离微柱液相谱技术，它是将高效液相谱的多种填料微粒移到毛细管中，以样品与固定相间的相互作用作为分离机制，以电渗流为流动相驱动力的谱过程。
最近，一些先进的检测仪器成功的用在了高效液相谱分析法上，使得高效液相谱的应用更广泛，并充分利用高效快速、选择性好、灵敏度高等优点，建立更加系统的成分分析方法。通过与质谱联用、梯度洗脱、柱切换技术、配合先进的检测技术，以及与分子生物学、现代分子药理学相结合，必将在中药分析中发挥很大作用。
(来源：中国化工仪器网)
文章链接：中国化工仪器网www.chem17/News/Detail/25291.html
谱法也叫层析法，它是一种高效能的物理分离技术，将它用于分析化学并配合适当的检测手段，就成为谱分析法。
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展开谱法的最早应用是用于分离植物素，其方法是这样的：在一玻璃管中放入碳酸钙，将含有植物素（植物叶的提取液）的石油醚倒入管中。此时，玻璃管的上端立即出现几种颜的混合谱带。然后用纯石油醚冲洗，随着石油醚的加入，谱带不断地向下移动，并逐渐分开成几个不同颜的谱带，继续冲洗就可分别接得各种颜的素，并可分别进行鉴定。谱法也由此而得名。现在的谱法早已不局限于素的分离，其方法也早已得到了极大的发展，但其分离的原理仍然是一样的。我们仍然叫它谱分析。一、谱分离基本原理：由以上方法可知，在谱法中存在两相，一相是固定不动的，我们把它叫做固定相；另一相则不断流过固定相，我们把它叫做流动相。谱法的分离原理就是利用待分离的各种物质在两相中的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的。使用外力使含有样品的流动相（气体、液体）通过一固定于柱中或平板上、与流动相互不相溶的固定相表面。
当流动相中携带的混合物流经固定相时，混合物中的各组分与固定相发生相互作用。由于混合物中各组分在性质和结构上的差异，与固定相之间产生的作用力的大小、强弱不同，随着流动相的移动，混合物在两相间经过反复多次的分配平衡，使得各组分被固定相保留的时间不同，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。二、谱分类方法：谱分析法有很多种类，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。从两相的状态分类：谱法中，流动相可以是气体，也可以是液体，由此可分为气相谱法（GC）和液相谱法（LC）。固定相既可以是固体，也可以是涂在固体上的液体，由此又可将气相谱法和液相谱法分为气-液谱、气-固谱、液-固谱、液-液谱。高效液相谱法是继气相谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新谱技术。高效液相谱是在气相谱和
经典谱的基础上发展起来的。现代液相谱和经典液相谱没有本质的区别。不同点仅仅是现代液相谱比经典液相谱有较高的效率和实现了自动化操作。经典的液相谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相谱法引用了气相谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9 107Pa）；谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。因此，高效液相谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、高效或现代液相谱法。高效液相谱法是在经典谱法的基础上，引用了气相
谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9´107Pa）；谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
特点
1．高压：液相谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过谱柱，必须对载液施加高压。一般可达150～350×105Pa。
2. 高速：流动相在柱内的流速较经典谱快得多，一般可达1～10ml/min。高效液相谱法所需的分析时间较之经典液相谱法少得多，一般少于1h 。
电视新闻评论3. 高效：近来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
税收楔子4.高灵敏度：高效液相谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。如荧光检测器灵敏度可达10-11g。另外，用样量小，一般几个微升。
5.适应范围宽：气相谱法与高效液相谱法的比较：气相谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相谱法进行分析。而高效液相谱法，只要求试样能制成溶液，而不需要气化，因此不受试样
挥发性的限制。对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80% ）原则上都可应用高效液相谱法来进行分离、分析。据统计，在已知化合物中，能用气相谱分析的约占20%，而能用液相谱分析的约占70～80%。
高效液相谱按其固定相的性质可分为高效凝胶谱、疏水性高效液相谱、反相高效液相谱、高效离子交换液相谱、高效亲和液相谱以及高效聚焦液相谱等类型。用不同类型的高效液相谱分离或分析各种化合物的原理基本上与相对应的普通液相层析的原理相似。其不同之处是高效液相谱灵敏、快速、分辨率高、重复性好，且须在谱仪中进行。高效液相谱法的主要类型及其分离原理
根据分离机制的不同，高效液相谱法可分为下述几种主要类型：
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1 ．液—液分配谱法(Liquid-liquid Partition Chromatography)及化学键合相谱(Chemically Bonded Phase Chromatography)
流动相和固定相都是液体。流动相与固定相之间应互不相溶（极性不同，避免固定液流失），有一个明显的分界面。当试样进入谱柱，溶质在两相间进行分配。达到平衡时，服从于下式：
式中，cs—溶质在固定相中浓度；cm--溶质在流动相中的浓度；Vs—固定相的体积；Vm—流动相的体
积。LLPC与GPC有相似之处，即分离的顺序取决于K，K大的组分保留值大；但也有不同之处，GPC中，流动相对K影响不大，LLPC流动相对K影响较大。
a. 正相液—液分配谱法(Normal Phase liquid Chromatography): 流动相的极性小于固定液的极性。
b. 反相液—液分配谱法(Reverse Phase liquid Chromatography): 流动相的极性大于固定液的极性。
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c. 液—液分配谱法的缺点：尽管流动相与固定相的极性要求完全不同，但固定液在流动相中仍有微量溶解；流动相通过谱柱时的机械冲击力，会造成固定液流失。上世纪70年代末发展的化学键合固定相（见后），可克服上述缺点。现在应用很广泛（70~80%）。
2 ．液—固谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入谱柱时，溶质分子(X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：中频变压器
Xm + nSa ====== Xa + nSm
盂兰盆节式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]
3 ．离子交换谱法(Ion-exchange Chromatography)
IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：
X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)
当交换达平衡时：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
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