李冠喜;吴小芹;叶建仁
【摘 要】长期或不当施用草甘膦会对非靶标生物和环境造成破坏作用.微生物是生物修复的重要生物资源,利用微生物及其产生的降解酶处理环境中有机磷农药的方法,已显示出良好的应用前景,是近年来研究有机磷农药降解的主要发展方向.研究分离松树根际土壤的高效解磷细菌多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对草甘膦的降解特性及其降解条件的优化.采用添加不同浓度草甘膦NA平板接种WS-FJ9菌株观察其对草甘膦的耐受性;分别以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源,探讨WS-FJ9菌株对草甘膦的利用状况;采用低进水量间歇式反应器法(FBR)测定了WS-FJ9菌株降解草甘膦动力学参数;利用Plackett-Burman(PB)、Central Composite Design(CCD)试验设计及响应面分析法(RSM)筛选与优化影响WS-FJ9菌株降解草甘膦的主要因素.WS-FJ9菌株有效降解草甘膦的最大耐受浓度为0.4％;WS-FJ9菌株在以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源培养基上均能正常生长;WS-FJ9菌株对草甘膦的亲和性常数(K值)为65 μL/mL,对草甘膦降解的极限浓度(Smin)为21.9.μL/mL;通过PB试验,筛选出3个影响菌株降解草甘膦的关键因素为培养温度、葡萄糖及硫酸铵的加 入量,通过CCD设计及响应面法优化分析得到影响草甘膦降解率的关键因素的二阶模型,确定了WS-FJ9菌株降解草甘膦的最优实验操作条件为:培养温度27.7℃,葡萄糖和硫酸铵的加入量分别为0.67、0.50 g/L.实验条件下WS-FJ9菌株对草甘膦的降解率最高为72.83％.
【期刊名称】《生态学报》
【年(卷),期】2013(033)021
beijing review
【总页数】10页(P6885-6894)
【关键词】多噬伯克霍尔德氏菌;降解;草甘膦;优化
【作 者】李冠喜;吴小芹;叶建仁
【作者单位】南京林业大学森林资源与环境学院,南京210037;连云港市农业科学院,连云港222006;江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室,南京210037;南京林业大学森林资源与环境学院,南京210037;江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室,南京210037;南京林业大学森林资源与环境学院,南京210037;江苏省有害生物入侵预防与控制重点实验室,南京210037
《手机里的秘密》
【正文语种】中 文
草甘膦(Glyphosate，简称GPA)又称农达，学名 N-(膦酸甲基)甘氨酸(C3H8NO5P)，是由美国孟山都公司(Monsanto)开发的一种有机磷除草剂，具有内吸作用，杀草谱广，主要用于果园、林地、农作物、免耕地等进行化学除草。尽管草甘膦具有高效、低毒、低残留等特点，但长期或不当施用对非靶标生物和环境造成的破坏作用不容忽视[1- 2]。近年来对草甘膦安全性的研究已成为焦点。刘攀[3]研究表明土壤环境中50%—80%的益虫死于残留的草甘膦污染。耿德贵等[4]研究发现草甘膦能明显地诱发黄鳝染体数目和结构畸变率上升。邓晓等[5]研究发现草甘膦对土壤微生物的种数量及土壤中细菌、放线菌和真菌生长速率均具有一定的抑制作用。Daruich等[6]、Fujii等[7]、Dallegrave等[8]分别以鼠类进行了草甘膦的毒性试验，结果表明，长期接触草甘膦可导致妊娠期雌鼠后代的大脑产生多功能性变异，导致胎儿的骨骼无法正常发育。Poulsen等[9]研究表明草甘膦能够穿透人类胎盘障碍进入胎儿室继而对人类胎儿的发育造成伤害。
微生物是生物修复的重要生物资源，利用微生物及其产生的降解酶处理环境中有机磷农药的方法，已显示出良好的应用前景，是近年来研究有机磷农药降解的主要发展方向。目前，
在我国已有高抗或降解草甘膦的菌株被分离筛选出来[10- 12]，大多属于假单孢菌属(Pseudomonas)、节杆菌属(Arthrobacter)、肠肝菌科菌(Enterobacteriaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)等。多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株为本实验室在前期研究中从松树根际筛选获得的1株高效解磷细菌，前期的研究表明，该菌对哺乳动物安全可靠，具有促进植物生长和生物防治的功能。为探讨该菌是否具有生物降解农药残留的功能以及该菌在试验条件下最大降解率究竟与哪些因素有关以及这些因素的水平对降解率的影响究竟有多大，为今后深入研究草甘膦降解菌制剂做好前期的准备工作，本研究采用添加草甘膦的NA平板接种该菌株观察其对草甘膦的耐受性；分别以草甘膦为唯一碳源、氮源或磷源，探讨其对草甘膦的利用状况；采用低进水量间歇式反应器法(FBR)测定其降解草甘膦动力学参数；在前期对该菌生长特性研究的基础上，利用Plackett-Burman (PB) 及Central Composite Design (CCD) 试验设计对影响其降解草甘膦有关的8个因素进行筛选优化。研究结果可为开发草甘膦降解菌剂实现农药残留的生物修复提供菌种资源和参考依据，对农林业的可持续发展及环境的保护具有重要意义。
1.1 供试菌株、草甘膦及降解培养基
供试菌株为多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株由本实验室分离筛选所得，已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC (No. CCTCC M2011435)[13]。供试草甘膦为四川贝尔化工集团有限公司生产(含量为30%)。供试降解培养基为唯一磷源(改良蒙金娜有机磷培养基)、唯一碳源和唯一氮源培养基[12]。
1.2 WS-FJ9菌株对草甘麟的耐受性检测
将WS-FJ9菌株分别接种于含草甘磷0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的NA平板上，28℃培养3 d，观察菌株的生长情况。
1.3 WS-FJ9菌株的唯一碳源、氮源和磷源试验
将WS-FJ9菌株活化后，用接种环挑取少量菌体接种于装有50 mL NB 液体培养基的100 mL三角瓶中，28℃、200 r/min振荡培养48 h。发酵液( 4℃，4629×g) 离心5 min，无菌生理盐水润洗菌体3次后，无菌生理盐水调节成浓度为1×108 cfu/mL的菌悬液。分别将1 mL菌悬液接种于50 mL唯一碳源、唯一氮源和唯一磷源培养基，以不加碳源、氮源、或磷源的培养基为各自空白对照。28℃、200 r/min摇床振荡培养3 d，离心后上清液采用HWλIOSγ型分光光度计测定600 nm处的吸光度。
1.4 草甘膦降解率的测定运动磁场
将1 mL菌悬液接种于含50 mL以草甘膦为唯一磷源培养基的100 mL三角瓶中(部分三角瓶中的装液量按试验要求进行)，28℃、200 r/min摇床振荡培养3 d后，降解发酵液转移至50mL离心管中，加入0.5 g无磷活性炭，采用SM- 650D型超声波细胞破碎仪进行细胞破碎20 min后离心 (4℃，4629×g) 10 min，取上清液测定无机磷含量；取5 mL草甘膦降解发酵液置于凯氏瓶中，加入9 mL的浓硫酸和1 mL高氯酸，用电炉消煮，至消煮液呈现透明，冷却后调节pH值至7.0，再定容至50mL，测定总磷含量。磷含量的测定采用钼锑抗比法[14]。草甘膦降解率=(M1-M2)/M1×100%(M1：培养前有机磷含量；M2：培养后有机磷含量；有机磷含量=总磷含量-无机磷含量)。
1.5 WS-FJ9菌株降解草甘膦动力学参数的测定
将WS-FJ9菌株的菌悬液按1%接种量接种到NB液体培养基上28℃、200 r /min振荡培养3 d后，取2 L发酵液( 4℃，4629×g) 离心5 min后，菌体用无菌生理盐水润洗3次后加入含2 L灭菌的唯一磷源基础培养基的容器内制成生化反应器，置于28℃恒温培养箱中。动力学参数测定参照周军等[15]的方法，采用FBR(低进水量间歇式反应器)法，草甘膦含量的测定按
阴离子
1.4的方法进行，将测定的动力学参数用下式计算极限浓度：
式中,Smin为极限浓度(μL/mL)；Ks为细菌对基质的亲和性常数(μL/mL)；ymax为细菌最大产率系数(mg/mg)；qmax为最大比基质利用速率(d-1)；b为细菌衰减系数(d-1)。
1.6 WS-FJ9菌株降解草甘麟PB试验设计
选取影响WS-FJ9菌株降解草甘膦的8个因素，采用Plackett-Burman(PB)设计方案进行关键变量的筛选。试验设计如表2所示，8个变量分别通过12次实验进行评价分析，每个变量通过两个水平(低水平-1和高水平+1)来检测。响应值通过降解率来衡量。每个变量的显著性通过P值和显著水平确定。
1.7 WS-FJ9菌株降解草甘麟中心复合试验及验证
采用中心复合试验设计(Central Composite Design，CCD)法对由Plackett-Burman筛选出的关键因素进行试验设计，同时固定其他非关键因素。中心复合试验包括含3个关键变量的20组实验，每个变量包含5个水平(表4)。当确定一个关键变量的最优水平，可以得到其它两个变量的等高线图和三维立体图，而确定这两个关键变量的最优值。回归模型的可信度
由决定系数(R2)进行评估。以PB试验、CCD试验确定的最佳降解因素，进行WS-FJ9菌株降解草甘膦试验，验证优化方案。
1.8 数据分析与处理
采用Office 2003和Design Expert 8.07(Stat-Ease Inc., Minneapolis, USA)软件进行PB、CCD试验设计、数据差异显著性检验(Plt;0.05)、回归分析及图表绘制。
2.1 WS-FJ9菌株对草甘膦的耐受性
NA平板上草甘膦含量从0.1%增加到0.4%的过程中，菌株的生长状况没有明显的变化，均表现为旺盛生长；草甘膦含量继续增加，菌株的长势逐渐减弱；当草甘膦达到0.8%时，菌株不能生长(表1)。表明多噬伯克霍尔德氏菌(Burkholderia multivorans)WS-FJ9菌株对草甘麟有一定的耐受能力，当草甘膦含量为0.4%时，菌株长势不减弱，说明菌株对草甘膦耐受的最大浓度为0.4%。
2.2 WS-FJ9菌株在唯一碳源、氮源和磷源培养基上的生长状况
WS-FJ9菌株在以草甘膦为唯一碳源、氮源和磷源培养基上均能正常生长。由图1可知，菌株在以草甘膦为唯一磷源的培养基上生长最好，唯一碳源培养基次之，唯一氮源培养基最差。因此，在后续试验中均采用以草甘膦为唯一磷源的培养基。
2.3 WS-FJ9菌株降解草甘膦的动力学参数
反应器中草甘膦的浓度始终维持在较低的水平，有利于探明微量有机物污染生物修复的机制。测定结果如下：Ks=65 μL/mL；ymax=0.31 mg/mg；qmax=1.625 d-1；b=0.127 d-1。把测定结果代入1.5的公式，经计算得到B.multivorans WS-FJ9降解草甘膦的极限浓度(Smin)的值为21.9 μL/mL。表明该菌可应用于微量有机物生物高度净化技术，对痕量农药的污染治理具有很好的应用潜力。
泰国屠杀2.4 WS-FJ9菌株降解草甘麟关键影响因素的筛选
Plackett-Burman试验设计及结果见表2。采用Design Expert 8.07软件对表3中的降解率数据进行回归分析，得到各影响因素的偏回归系数(表3)。由表3可看出，X2(初始pH)、X5(葡萄糖)、X6((NH4)2SO4)表现为负效应，而其它因素表现为正效应。因素X1(温度)、X5(葡
金浩振
萄糖)、X6((NH4)2SO4)为主要影响因子，其贡献值分别为18.85%、39.09%和29.01%，而其他因素对响应值降解率为低值影响。经影响因素筛选，得到以降解率为响应值的线性回归方程：Y=35.24+3.54X1-4.07X5-35.07X6，方程中Y为预测的降解率，Xi为变量。方差分析模型的P值为0.0007，决定系数(R2)为0.8705，调整系数(adj R2)为0.8220，变化系数(CV)为14.30%，精密度为12.570，表明该数学模型能较好的表征实验的实际情况。
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