•开发与研究•
王希越１ꎬ王洪伟２ꎬ石一雯１ꎬ王㊀月１ꎬ娄大伟１
(１.吉林化工学院化学与制药工程学院ꎬ吉林吉林㊀１３２０２２ꎻ２.吉林省中北化工工程设计有限公司ꎬ吉林吉林㊀１３２０２２)
摘㊀要：以酵母菌为研究对象ꎬ对原位酯交换法制备生物柴油的工艺条件进行研究ꎮ通过单因素实验优化影响原位酯交换工艺参数ꎬ包括催化剂用量㊁衍生试剂用量㊁反应时间ꎬ利用气相谱－质谱分析平台ꎬ得到酯总峰面积为评价指标ꎮ结果表明ꎬ最优工艺条件为:５０ｍｇ酵母干粉ꎬ催化剂ＫＯＨ浓度０.２ｍｏｌ/Ｌꎬ衍生试剂甲醇８００μＬꎬ超声时间３０ｍｉｎꎮ得到柴油成分主要为棕榈酸甲酯和十六烯酸甲酯ꎬ占总量７２％ꎬ其次为油酸甲酯㊁硬脂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯ꎮ 关键词：生物柴油ꎻ酵母菌ꎻ原位酯交换ꎻ气相谱－质谱
中图分类号:ＴＱ９２９㊀㊀㊀文献标识码:Ａ㊀㊀㊀文章编号:１００３－３４６７(２０１９)１１－００１７－０３
ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆＹｅａｓｔＢｉｏｄｉｅｓｅｌｂｙＩｎ－ｓｉｔｕＴｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＷＡＮＧＸｉｙｕｅ１ꎬＷＡＮＧＨｏｎｇｗｅｉ２ꎬＳＨＩＹｉｗｅｎ１ꎬＷＡＮＧＹｕｅ１ꎬＬＯＵＤａｗｅｉ１(１.ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇꎬＪｉｌｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＪｉｌｉｎ㊀１３２０２２ꎬＣｈｉｎａꎻ２.ＪｉｌｉｎＺｈｏｎｇｂｅｉＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＤｅｓｉｇｎＣｏ.ＬｔｄꎬＪｉｌｉｎ㊀１３２０２２ꎬＣｈｉｎａ.)Ａｂｓｔｒａｃｔ:Ｔａｋｅｙｅａｓｔａｓｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｏｂｊｅｃｔꎬｔｈｅｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌｂｙｉｎ－ｓｉｔｕｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｓｓｔｕｄｉｅｄ.Ｔｈｅｐａｒａｍｅｔｅｒｓｏｆｉｎ－ｓｉｔｕｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔꎬｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃａｔａｌｙｓｔｄｏｓａｇｅꎬｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｒｅａｇｅｎｔｄｏｓａｇｅꎬｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅａｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｗｉｔｈｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ.Ｕｓｉｎｇｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙａｎａｌｙｓｉｓｐｌａｔｆｏｒｍꎬｔｈｅｔｏｔａｌｐｅａｋａｒｅａｏｆｅｓｔｅｒｉｓｏｂｔａｉｎｅｄａｓｔｈｅｅ￣ｖａｌｕａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ.Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｔｈａ
ｔｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｐｒｏｃｅｓｓｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓａｒｅ５０ｍｇｙｅａｓｔｄｒｙｐｏｗｄｅｒꎬｃａｔａｌｙｓｔｐｏｔａｓｓｉｕｍｈｙｄｒｏｘｉｄｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ０.２ｍｏｌ/Ｌꎬｄｅｒｉｖａｔｉｚａｔｉｏｎｒｅａｇｅｎｔｍｅｔｈａｎｏｌ８００μＬꎬｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｔｉｍｅ３０ｍｉｎ.Ｔｈｅｍａｉｎｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｂｉｏｄｉｅｓｅｌａｒｅｍｅｔｈｙｌｐａｌｍｉｔａｔｅａｎｄｍｅｔｈｙｌｈｅｘａｄｅｃｅｎｏｉｃａｃｉｄꎬａｃｃｏｕｎｔｉｎｇｆｏｒ７２％ꎬｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙｍｅｔｈｙｌｏｌｅａｔｅꎬｍｅｔｈｙｌｓｔｅａｒａｔｅａｎｄｍｅｔｈｙｌｍｙｒｉｓｔａｔｅ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:ｂｉｏｄｉｅｓｅｌꎻｙｅａｓｔꎻｉｎ－ｓｉｔｕｔｒａｎｓｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎꎻｇａｓｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｍａｓｓｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ
０㊀前言
生物柴油是以油料物质(大豆㊁油菜籽㊁动物油
脂㊁餐饮废弃油脂)或产油酵母菌㊁微藻等为原料ꎬ
与甲醇或乙醇通过酯化或酯交换反应制得的可替代
石化柴油的绿清洁燃料ꎬ其具有无毒㊁可降解㊁含
翡翠赌石传奇硫量少㊁可再生性等优势ꎬ是绿新能源发展的重要
研究目标[１]ꎮ酵母菌㊁微藻等微生物由于生长速度快ꎬ体内油脂含量高ꎬ且不占用土地㊁粮食等资源ꎬ被
认为是理想的生物柴油生产原料[２－３]ꎮ
微生物油脂生产过程包括细胞培养㊁收集㊁脂提取和酯化ꎬ其中脂提取过程中需要消耗大量甲醇㊁氯
仿等有机溶剂ꎬ严重污染环境ꎬ危害人类身体健
康[４]ꎮ近年提出原位酯交换方法制备生物柴油ꎬ该方法可同时实现脂提取与转酯化ꎬ减少有机试剂使三讲一落实
用ꎬ是一种高效的生物柴油制备方法[５]ꎮ其在油藻生物柴油制备工艺中研究较多ꎬ但在酵母菌生物柴油制备工艺中研究较少[６－８]ꎮ王为国等[８]采用浓硫酸为催化剂ꎬ对原位酯交换制备蛋白核小球藻生物柴油条件考察ꎬ优化水与藻粉质量比㊁酯化温度㊁时间㊁催化剂用量㊁甲醇用量ꎮ在原位酯交换方法中可采用超声波辅助来提高反应速率和效率ꎮ本文以酵
㊀㊀收稿日期:２０１９－０９－１０
㊀㊀作者简介：王希越(１９８６－)ꎬ女ꎬ博士ꎬ讲师ꎬ研究方向为基于质谱技术方法的开发与应用ꎬＥ－ｍａｉｌ:ｗａｎｇｘｉｙｕｅ１１９＠１６３.ｃｏｍꎮ ７１
第１１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王希越等：原位酯交换制备酵母菌生物柴油
母菌为原料ꎬ考察超声波辅助原位酯交换制备生物柴油工艺条件ꎬ确定最佳超声反应时间㊁催化剂
ＫＯＨ的用量㊁衍生试剂甲醇的用量ꎮ
１㊀实验部分
１.１㊀试剂与仪器
试剂：正己烷㊁甲醇ꎬ谱级ꎬ上海阿拉丁ꎻ氯化钠ꎬ分析纯ꎬ辽宁泉瑞试剂有限公司ꎻ氢氧化钾ꎬ分析纯ꎬ国药集团化学试剂有限公司ꎮ
仪器:ＢＸＭ－３０Ｒ立式压力蒸汽灭菌器ꎬ上海实业有限公司ꎻＢＳＤ－ＹＸ３２００智能精密摇床ꎬ上海博迅实业有限公司ꎻＡＳ３１２０Ｂ超声波清洗器ꎬ天津奥特赛恩斯仪器有限公司ꎻ７８９０Ｂ气相谱仪ꎬ美国Ａｇｉｌｅｎｔ公司ꎻＭ７－３００ＥＩ质谱仪ꎬ北京普析通用仪器有限责任公司ꎻＨ１６５０离心机ꎬ湖南湘仪实验室仪器开发有限公司ꎻＮ－ＥＶＡＰ１１１氮吹仪ꎬ美国Ｏｒｇａ￣ｎｏｍａｔｉｏｎꎮ
１.２㊀菌株及培养条件
酵母菌Ｓ２８８ｃ在３０ħꎬ２００ｒ/ｍｉｎ条件下ꎬ用液体ＹＰＤ培养基培养ꎮ首先ꎬ挑取单菌落到２０ｍＬＹＰＤ液体培养基中活化培养１２ｈꎬ之后转移１ｍＬ菌液到５０ｍＬ液体ＹＰＤ培养基中继续培养９ｈꎮ菌液经３０００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ得到菌体用去离子水洗一次ꎬ然后放到干燥箱内烘干备用ꎮ
１.３㊀生物柴油的制备
称取５０ｍｇ干酵母粉ꎬ加２ｍＬ正己烷ꎬ再加入８００μＬ０.２ｍｏｌ/Ｌ的ＫＯＨ/ＣＨ３ＯＨ溶液ꎬ超声３０ｍｉｎ反应结束后ꎬ加入５％ＮａＣｌ溶液３００μＬꎬ涡旋１ｍｉｎ混匀ꎬ静置１０ｍｉｎꎬ１００００ｒ/ｍｉｎ离心５ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ用氮气吹干ꎬ最后１００μＬ正己烷溶解ꎬ取上清液１μＬ进行ＧＣ－ＭＳ分析ꎮ
１.４㊀ＧＣ－ＭＳ检测条件
谱条件：谱柱为安捷伦ＨＰ－５毛细管柱(３０ｍˑ０.３２ｍｍˑ０.２５μｍ)ꎬ进样口温度２６０ħꎬ分流比１０ʒ１ꎮ程序升温设置：初始温度１５０ħꎻ以２０ħ/ｍｉｎ升温至２１４ħꎬ保持５ｍｉｎꎻ再以１０ħ/ｍｉｎ升温至２８０ħꎬ保持５ｍｉｎꎬ载气(９９.９９９５％高纯氦气)流速１.２ｍＬ/ｍｉｎꎮ质谱条件：离子源温度２３０ħꎬ传输线温度２８０ħꎬ溶剂的延迟时间２ｍｉｎꎬ选择离子扫描模式ꎮ
２㊀结果与讨论
实验以酵母菌为原料ꎬＫＯＨ为催化剂ꎬ甲醇为衍生试剂ꎬ通过原位酯交换制备生物柴油ꎬ气相谱－质谱分析其成分主要为棕榈酸甲酯㊁十六烯酸甲酯㊁油酸甲酯㊁硬脂酸甲酯和肉豆蔻酸甲酯ꎮ单因素实验优化超声时间㊁ＫＯＨ用量和甲醇用量ꎮ峰面积和产量是正相关的ꎬ峰面积越大ꎬ产量越大ꎬ没有换算式ꎬ是直接相关的ꎮ ２.１㊀超声时间的影响
称取５０ｍｇ干酵母粉ꎬ加入４００μＬ０.０５ｍｏｌ/Ｌ的ＫＯＨ－ＣＨ３ＯＨ溶液ꎬ考察不同超声时间(５㊁１０㊁２０㊁３０㊁４０ｍｉｎ)对酯交换反应影响ꎬ结果如图１所示ꎮ可以看出ꎬ随着反应时间增加ꎬ酯交换效率逐渐增加ꎬ３０ｍｉｎ后得到酯总含量最大ꎬ之后酯量有所减少ꎮ这可能是由于时间延长ꎬ酯交换反应越来越充分ꎬ但时间过长ꎬ超声使反应体系温度升高ꎬ随溶剂挥发造成产物损失
ꎮ
图１㊀超声时间对生物柴油产量的影响
２.２㊀ＫＯＨ用量的影响
实验选用ＫＯＨ为催化剂ꎬ称取５０ｍｇ干酵母粉ꎬ分别加入０.０１㊁０.０５㊁０.２０㊁０.６０㊁１.００ｍｏｌ/Ｌ的ＫＯＨ－ＣＨ３ＯＨ溶液４００μＬꎬ超声反应３０ｍｉｎꎬＫＯＨ用量对生物柴油产量的影响如图２所示
ꎮ
图２㊀ＫＯＨ用量对生物柴油产量的影响
由图２可看出随ＫＯＨ浓度增加ꎬ生物柴油产量逐渐增加ꎬ在０.２ｍｏｌ/Ｌ时达到最大ꎮ之后ꎬＫＯＨ浓度再增大ꎬ柴油产量呈下降趋势ꎮ可推测催化剂ＫＯＨ用量增加可以加快反应速率ꎬ增加柴油产量ꎬ
８１ 河南化工
ＨＥＮＡＮＣＨＥＭＩＣＡＬＩＮＤＵＳＴＲＹ㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀２０１９年㊀第３６卷
但ＫＯＨ过量后ꎬ其可能与产生的酯发生皂化反应ꎬ使柴油产量下降ꎮ
２.３㊀甲醇用量对生物柴油产量的影响
称取５０ｍｇ干酵母粉ꎬ分别加入２００㊁４００㊁６００㊁８００㊁１０００μＬ的０.２ｍｏｌ/ＬＫＯＨ－ＣＨ３ＯＨ溶液ꎬ超声３０ｍｉｎꎬ考察甲醇用量对生物柴油产量影响ꎬ结果如图３所示
狐狸和乌鸦教学设计
ꎮ
图３㊀甲醇用量对生物柴油产量影响
由图３可看出ꎬ甲醇用量在２００~６００μＬꎬ柴油产量几乎没有变化ꎬ当甲醇增加到８００μＬ时ꎬ柴油产量急剧上升ꎬ再增加甲醇用量ꎬ柴油产量维持不变ꎮ
２.４㊀方法重复性考察
称取５份酵母干粉ꎬ按１.３节方法处理ꎬＧＣ－
ＭＳ定量分析后ꎬ计算各脂肪酸酯相对标准偏差ꎬ结果如表１所示ꎮ
表１㊀脂肪酸甲酯相对标准偏差
脂肪酸酯保留时间ｍｉｎ
定量离子ＲＳＤ(ｎ＝５)％
肉豆蔻酸甲酯３.５１７４１０.５棕榈烯酸甲酯４.６１６９９.５棕榈酸甲酯４.７６７４９.３油酸甲酯６.４８６９１０.１硬脂酸甲酯
江淮官话６.７５７４落井
１０.４㊀㊀由表１可知ꎬ５组平行样相对标准偏差<１１％ꎮ可见ꎬ该方法有较好的重复性ꎮ
３㊀结论
采用原位酯交换法制备酵母菌生物柴油ꎬ单因素优化实验结果显示最佳工艺条件:５０ｍｇ酵母干粉ꎬ甲醇的用量为８００μＬꎬＫＯＨ用量为０.２ｍｏｌ/Ｌꎬ超声时间为３０ｍｉｎꎮ最佳条件下ꎬ平行处理５份样品中各脂肪酸甲酯相对标准偏差<１１％ꎮ生物柴油成分包括肉豆蔻酸甲酯(５％)㊁十六烯酸甲酯(２４％)㊁棕榈酸甲酯(４８％)㊁油酸甲酯(１３％)㊁硬脂酸甲酯(１０％)ꎮ参考文献:
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４.
９１ 第１１期㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀王希越等：原位酯交换制备酵母菌生物柴油
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