佚 名
【摘 要】为建立大豆脂肪酸组分的绝对定量方法，采用加热甲酯化提取法和气相谱分析法（ GC），以5种脂肪酸甲酯（棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯）为标准样品，在制定5种脂肪酸甲酯组分的标准曲线（ R2﹥0.99）和回归方程的基础上，建立了大豆脂肪酸组分的定量测定方法。该方法可以准确检测大豆籽粒中脂肪酸组分的绝对含量。通过对4个油份含量不同的大豆品种脂肪酸含量测定以及与粗脂肪含量的比较分析发现，该方法可显著提高籽粒中的脂肪酸提取率和检测效率，其检测的总脂肪酸含量占总油脂含量的94%以上。该方法不仅能检测样品中5种脂肪酸组分的相对百分比含量，还可以准确计算出籽粒中各个脂肪酸组分的绝对含量，对大豆脂肪酸检测及育种具有重要意义。%To develop an absolute quantitative method for fatty acid determination,a quantitative method for fatty acid determination was established through heated -methylation extraction method and gas chromatography ( GC)analysis. Five individual fatty acid methyl esters( i. e. methyl palmitate,methyl stearate,methyl oleate, methyl linoleate and methyl linolenate)w ere used as the standard samples. According to the standard curves( R2 ﹥0. 99)and the regression equations of five kinds of fatty acid methyl esters,the absolute concentration of fatty acid of soybean seeds could be determined accurately. Through determination of fatty acids in four soybean varieties with different oil content and comparison of the total fatty acid contents with the total fat contents of them,we suggested the extraction efficiency and detection reproducibility of fatty acid could be significantly improved. In addition,the total concentration of five fatty acid detected by this method accounted for more than 94% of total fat content in soy-bean seeds. It concluded that this method could be used to detect not only the relative percentage content but also the absolute concentration of individual fatty acids in soybean seeds,which could play an important role in soybean fatty acid determination and breeding.
【期刊名称】《中国油料作物学报》贺知章
【年(卷),期】2015(000)004
普查与抽样调查【总页数】6页(P548-553)
【关键词】大豆;脂肪酸;定量测定;气相谱( GC)
【正文语种】中 文
【中图分类】S565.1;O657.63
大豆是世界植物油的主要原料。大豆籽粒中含有20%左右的油脂，其主要成分是脂肪酸，约占总脂肪含量的90%，除脂肪酸外还包含约7%的磷脂和3%的糖脂[1]。大豆脂肪酸主要包含5种组分，即饱和脂肪酸棕榈酸(16∶0)和硬脂酸(18∶0)，不饱和脂肪酸油酸(18∶1)、亚油酸(18∶2)和亚麻酸(18∶3)，分别约占脂肪酸总量的11.36%、3.30%、54.87%、21.36%和8.96%，达到了总脂肪酸含量的99.85%。除上述五种脂肪酸组分以外，还有少量的豆蔻酸(14∶0)、花生酸(20∶0)以及微量的棕榈油酸(16∶1)、月桂酸(12∶0)和二十二碳酸(22∶0)等脂肪酸成分[1,2]。大豆油脂中的不饱和脂肪酸有降低患心血管疾病风险的作用，可降低人体中的有害胆固醇，但多不饱和脂肪酸，尤其是亚麻酸，容易被脂肪氧化酶氧化，从而产生豆腥味[3]。改良大豆脂肪酸组分，提高其抗氧化性是近年来大豆脂肪酸育种的主要目标[4,5]。因此，大豆脂肪酸组分的定性定量检测技术成为大豆脂肪酸组分改良研究工作中不可缺少评价手段。
大豆脂肪酸组分的检测方法主要包括近红外反射光谱分析法(NIRS)[6～8]、高效液相谱法(HPLC)[9,10]和气相谱法(GC)[11～13]，而应用最为广泛的当属气相谱法。目前，针对大豆脂肪酸的检测主要以相对百分比含量测定为主，无法准确反映籽粒中脂肪酸组分的绝对含量，因此亟需建立大豆脂肪酸组分的绝对定量方法。本研究利用5种大豆脂肪酸甲酯为标准样品，采用加热甲酯化提取法和气相谱分析方法(GC)相结合，制定了5种脂肪酸甲酯组分的检测标准曲线和回归方程，建立了定性定量鉴定不同大豆脂肪酸组分的绝对含量的气相谱方法，并优化了提取和GC检测条件，实现了大豆脂肪酸组分含量检测的定量化和计算方法的标准化，为加速大豆脂肪酸育种和基础研究提供技术支撑。
1.1 材料
大豆品种4个，包括3个低油份含量的大豆品种，鲁黑豆2号(LHD2)、南汇早黑豆(NHZ)、中黄13(ZH13)；1个高油份含量的大豆品种，中黄35(ZH35)。2014年4个大豆品种种植于中国农业科学院作物科学研究所昌平试验基地，行长2 m，行距45 cm，株距10 cm，单行区，三次重复。
1.2 试剂
五种脂肪酸甲酯标准样品：棕榈酸甲酯(methyl palmitate)、硬脂酸甲酯(methyl stearate)、油酸甲酯(methyl oleate)、亚油酸甲酯(methyl linoleate)和亚麻酸甲酯(methyl linolenate)，均购自于Sigma公司；正己烷(谱纯)和甲醇钠(分析纯，0.05 mol/L)均购自于北京华夏远洋科技有限公司。
1.3 脂肪酸组分的气相谱检测条件
大豆脂肪酸含量采用岛津GC-2010气相谱仪进行定性定量检测。分析检测条件为，谱柱：RTX-Wax (30m×0.25mm×0.25μm)；自动进样，进样量：lμL；采用分流进样，分流比：40∶1；进样口温度：250℃；载气：氮气，54mL·min-1；氢气，40mL·min-1；空气，400mL·min-1；采取程序升温的方式：180℃保持1.5min，以10℃·min-1升到210℃，保持2min，然后以5℃·min-1升到220℃保持5min；检测器：火焰离子检测器(FID)，温度为300℃；每个样品检测20min，样品检测之间间隔2min。
1.4 脂肪酸标准曲线的制作
准确称取棕榈酸甲酯标准样品 20.0mg 放入谱专用样品瓶中，加1.0mL正己烷至标准样
品完全溶解。然后从样品瓶中取500μL溶液放入另一样品瓶中，加入等体积正己烷，混合均匀，以此类推进行半倍稀释，制作不同梯度的标准溶液，共设7个梯度。对稀释好的标准溶液进行气相谱分析，以标准溶液浓度为横坐标，谱峰面积为纵坐标绘制不同浓度梯度的标准曲线。其余4种脂肪酸甲酯标准样品的处理方法与棕榈酸甲酯相同。
1.5 豆粉脂肪酸提取
简易甲酯化提取法(方法一)：准确称取大豆粉30.0mg，放入2.0mL的离心管中，加入1.0mL正己烷浸提20min；然后加入1.0mL 0.5mol/L甲醇钠溶液进行甲酯化，充分摇匀10min，使其充分甲酯化，静置，取上清液放置于谱专用样品瓶中，4℃冰箱保存待检测。
加热甲酯化提取法(方法二)：准确称取大豆粉30.0mg，放入2.0mL的离心管中，加入1.0mL正己烷，60℃加热浸提20min，间隔充分摇匀；然后加入1.0mL 0.5mol/L甲醇钠溶液进行甲酯化，充分摇匀10min，使其充分甲酯化；静置，取上清液放置于谱专用样品瓶中，4℃冰箱保存待检测。
1.6 粗脂肪的NIRS检测
马萨诸塞紧急状态
采用近红外光谱分析仪(Bruker)检测大豆样品的粗脂肪含量。取研磨大豆粉10.0g左右，用近红外光谱仪(MATRIX-1)分析大豆籽粒中粗脂肪含量。每个样品重复扫描3次，利用OPUS 4.2软件的Quant2方法，以大豆粗脂肪豆粉为模型获得测试样品的粗脂肪含量。
1.7 数据统计分析
根据5种脂肪酸标准样品的保留时间和峰面积进行定性定量分析各个脂肪酸组分，依据表1中相应各组分公式计算大豆样品中各脂肪酸组分的绝对含量。使用Excel 2010进行数据统计，并制作标准曲线。采用SAS 9.1软件进行方差分析和差异显著性分析。
2.1 大豆脂肪酸组分的定性分析
以5种脂肪酸甲酯为标准样品，采用岛津GC2010气相谱仪对5种组分分别进行分析，可以准确确定5种脂肪酸甲酯组分的出峰时间。如图1所示，棕榈酸甲酯、硬脂酸甲酯、油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯的出峰时间分别为5.53、7.87、8.15、8.77和9.72 min，据此可对不同脂肪酸组分进行定性。
2.2 脂肪酸甲酯标准曲线的制作
采用半倍稀释法对5种脂肪酸甲酯组分进行GC分析，并制作了针对不同脂肪酸甲酯组分的浓度梯度标准曲线。由图2可以看出，油酸甲酯、亚油酸甲酯和亚麻酸甲酯3种脂肪酸甲酯组分的浓度梯度范围在0.2-40.0mg/mL内的线性关系最好，其决定系数R2均大于0.99，而棕榈酸甲酯和硬脂酸甲酯的浓度梯度范围在0.2-20.0mg/mL内的线性关系表现最好，其决定系数R2也均大于0.99。依据大豆籽粒中各个脂肪酸组分的真实含量推算，该检测范围基本可以覆盖大豆籽粒中各个脂肪酸组分绝对含量浓度范围，表明在上述标准曲线浓度范围内可以准确检测出各个脂肪酸组分的绝对含量。
2.3 两种大豆脂肪酸提取方法测定效果比较
经不同脂肪酸甲酯标准样品的出峰时间定性后，依据不同组分的峰面积，参照脂肪酸甲酯标准曲线和各脂肪酸组分绝对含量的计算公式(表1)，可以准确计算出不同大豆品种籽粒中5种脂肪酸组分的绝对含量和脂肪酸组分的总含量(表2)。通过对比简易甲酯化提取法(M1)[16]和改良加热甲酯化提取法(M2)两种提取方法对大豆脂肪酸的提取效率，发现两种方法所检测的脂肪酸组分绝对含量间显著或者极显著差异(表2)。
白鹭课文教材解读为了验证不同提取方法对总脂肪酸的提取效率的影响，本文采用近红外(NIRS)的方法快速
测定了4个大豆品种豆粉中的粗脂肪含量(表2)。通过比较分析发现，改良加热甲酯化提取法所提取的5种主要脂肪酸总含量占粗脂肪含量的94.04%～97.69%，而简易提取法所提取脂肪酸含量仅占粗脂肪含量的62.43%～74.00%。由此可见，经过改良加热甲酯化提取法的提取效率显著高于简易甲酯化提取法，表明改良加热甲酯化提取法可以相对有效地提取大豆籽粒中绝大部分脂肪酸组分，基本上可以反映大豆籽粒中的5种脂肪酸的总油份相对含量。
2.4 方法重现性分析
为了验证该GC检测方法的重现性，对同一大豆样品的检测实验设置了3个重复。以4个大豆品种为材料，对其脂肪酸组分的实验重复进行差异显著性分析。结果发现，4个品种的各种脂肪酸组分的重复间差异均不显著(表3)，表明该GC检测方法所检测的大豆脂肪酸组分绝对含量准确可靠，重现性好，可以为大豆脂肪酸辅助育种服务。
网络采集3.1 提取方法的比较
大豆脂肪酸提取的相关研究中，不同研究者所采用的脂肪酸甲酯化提取方法存在差异，所
使用的提取和甲酯化试剂也各不相同。目前，大多数研究者采用索氏提取法和超临界CO2萃取法，从不同样品中提取脂肪酸，但此法耗时较长，步骤繁琐。张颖君等用苯∶石油醚=1∶1的提取液提取5min，0.5mol·L-1的甲醇钠甲酯化7min，对大豆脂肪酸的提取和甲酯化进行了条件优化[14]。本研究采用加热甲酯化法提取大豆脂肪酸，与Sukhija等所采用的索氏抽提、CO2超临界法等传统方法相比，操作简便快捷，可检测微量样品，提高大豆脂肪酸提取效率[15]。苗兴芳等采用快速气相谱分析法以石油醚等混合物为提取液进行脂肪酸提取[16]，本研究以正己烷代替石油醚等混合物，减少了测定样品中杂质的种类。此外，在甲酯化过程中，Metcalfe等用甲醇试剂加热至沸腾对样品甲酯化，本研究甲酯化试剂以简易提取法中较安全的甲醇钠替代剧毒的甲醇[17]，在保证甲酯化效果的同时，一定程度提高了试验的安全性。此外，于福宽等采用大豆脂肪酸简易甲酯化提取法[18]，但提取不够充分，不能用于脂肪酸绝对含量的测定，本研究采用加热甲酯化法，与简易提取法相比，可较为完全地将大豆脂肪酸甲酯化，且加热对脂肪酸各组分含量的影响较小[19]，可以保证本研究所测定的脂肪酸绝对含量的准确性，因此甲酯化是否完全是本实验中保证检测准确性的关键因素。
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