疑问代词王汉军;白华民;郝金奇;余艳琴
【摘 要】目的:初步建立布鲁菌的PCR检测技术.方法:对疑似布病患者血液进行采样培养,提取菌落DNA,通过16S rDNA基因引物和布鲁菌通用引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳检测结果.结果:样品的16S rDNA扩增产物为1 500 bp,IS711基因扩增产物为63 bp,可以确认病人血液中含有布鲁菌.结论:细菌的分离培养结合PCR方法检测在布病的诊断中具有良好的应用前景. 【期刊名称】《包头医学院学报》
【年(卷),期】2012(028)006
【总页数】传奇故事20102页(P22-23)
【关键词】布鲁菌;PCR;16S rDNA;琼脂糖凝胶电泳
【作 者】王汉军;白华民;郝金奇;余艳琴
【作者单位】锡林郭勒盟东乌旗阿拉坦合力卫生院,内蒙古,锡林郭勒盟,026300;包头医学院;包头医学院;包头医学院
【正文语种】中 文
布鲁菌病，简称布病，是布鲁菌引起的人畜共患的急性或慢性传染病，属自然疫源性疾病，临床上主要表现为病情轻重不一的发热、多汗、关节痛等。布病在世界范围内广泛流行，不仅影响畜牧养殖业和旅游业的发展，损害职业人的健康，还对食品安全、公共安全等领域造成威胁。
布病的诊断需要结合病人的流行病学接触史、临床表现和实验室检查结果来综合判断。由于目前没有有效的预防人布病的疫苗，早发现、早诊断、早可能是控制人布病的有效措施。实验室诊断是布病确诊的重要依据，目前实验室检测方法主要包括基于抗原抗体的血清学检测方法和分离培养方法［1］。血清学检测方法简便、快速，一直作为实验室诊断的主要方法，但难以鉴别出急性早期患者，不能为流行地区人筛查及后患者随访提供诊断依据。分离培养布鲁菌是确诊布病的最佳证据，但由于费时、出菌率低、生物安全等问题，临床应用较少。
综合自动化
聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，因其敏感、快速、无需活菌操作等优点，在布病诊断方面具有一定的价值，特别是可对急性早期患者随访后的效果评价提供诊断依据［2］。本文结合了分离培养和PCR检测两种方法各自的优点，对疑似布病患者的血液进行分离培养，提取菌落DNA后应用PCR方法对其进行鉴定，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 样本 血液样本来源于布病门诊就诊人员，包括患者、可疑患者68例。采集患者血液5～10 mL，取4 mL血液加到双向培养基37℃培养至少7 d。
1.2 方法
1.2.1 细菌培养 在细菌培养瓶中37℃连续培养7 d，每天观察菌株生长情况，并且重新接种。
1.2.2 模板制备 采用接种环刮取固相培养基表面的菌落置入含有300 μL生理盐水的1 mL离心管中，煮沸2 h，3 000 rpm离心10 min，取上清用于PCR。
1.2.3 PCR扩增 16S rDNA基因扩增引物为:F:5’-AGAGTTTGATCCTGCCTCAC-3’，R:5’-ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’，产物为1 500 bp;布氏杆菌通用引物为:F:5’-GCTTGAAGCTTGCGGACAGT-3，R:5’-GGCCTACCGCTGCGAAT-3’，产物为63 bp。PCR反应体系为25 μL，含有10×PCR buffer 2.5 μL，dNTPs(5 mmol/L)2.5 μL，MgCL2(25 mmol/L)2.5 μL，Taq 酶 5 U，模板 DNA 5 μL，上下游引物各10 pmol。16S rDNA的PCR扩增条件为95℃预变性5 min，94℃变性40 s，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环;IS711基因扩增条件为95℃预变性5 min，94℃变性40 s，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，共35个循环。
2 结果
2.1 培养物观察 血液培养瓶中液相培养基变浑浊。在透射光下，固相培养基中有光滑型的呈针尖状的菌落，有浅黄光泽;在折射光下，菌落呈蓝白，略显乳白，微隆起、透明，菌落直径多在1.0 mm左右［3］。
2.2 PCR反应扩增16S rDNA 凝胶成像系统下观察DNA条带，16S rDNA基因产物为1 500 bp，见图1。寿亲养老新书
明报
2.3 PCR反应扩增布鲁菌IS711基因 凝胶成像系统下观察DNA条带，产物大小为63 bp，见图1。
图1 PCR扩增产物M:Marker;1、2为布鲁菌IS711基因扩增产物;3、4为16S rDNA扩增产物叉车技术
3 讨论
布病常常引起动物流产、不孕等症状，流行广泛，几乎遍布世界各地。PCR检测方法快速、敏感、特异，不需要操作活菌，减少了实验室暴露污染的机率，缩短了实验所用的时间，并能检测到标本中较低丰度的病原体，适合布鲁氏菌这种高危险性病原体的检测。本实验针对插入性序列IS711设计了PCR实验，在临床上对免疫学诊断为患者、可疑患者人进行检测。研究资料表明，布氏杆菌 IS711(插入序列)在数量和位置上都很保守，所有的种在单染体上都含有至少1个拷贝的IS711，IS711在不同种的布鲁氏菌基因组中插入位置存在差异，根据该插入序列位置的多样性，可以建立核酸检测方法，甚至可以鉴别不同的种。而采用16S rDNA序列分析对菌株进行鉴定和检测，通过16S rDNA的PCR扩增及其产物测序，可以进行快速诊断，能够区分不同种源的布鲁菌，可用于布鲁菌种属的快速鉴定和流行病学调查，具有良好的特异性、灵敏度和稳定性。因此，用PCR方法对布病早期
的患者及药物后患者进行诊断，具有较好的应用前景［4］。
单一PCR诊断技术对于人布病的可以提供参考，但由于布鲁氏菌可能受到药物、环境等因素的影响而发生核酸变异，造成靶序列缺失，或与某些细菌的基因组存在共同序列而出现假阳性结果，发展多重PCR诊断技术可能会解决上述问题。可以把PCR检测方法列入急性布病诊断标准中，以克服现有血清学方法的限制。由于目前经常出现不典型布鲁氏菌株，特别是长期用药、免疫接种，可能导致某些抗原基因发生变异，针对某个靶标抗原基因可能出现缺失，发展PCR不仅可用于布病的鉴定，还可以提高检测的敏感性。
参考文献
［1］蔡一非，钟旗，伊日盖，等.两奶牛场布氏杆菌分离鉴定及四种血清学检测方法比较［J］.中国人兽共患病学报，2009，25(5):456-459.
［2］李华，周向梅，赵德明.布氏杆菌的诊断及防治//中国畜牧兽医学会，反刍动物疾病专题［C］，北京:2010，363-366.
［3］甄清.人布鲁氏菌病标准化PCR诊断方法及BP26基因标记疫苗研究［吉林大学博士学
位论文］［D］.吉林:吉林大学，2009.
［4］朱战波，周玉龙，朱洪伟，等.流产布氏杆菌的检测及生物型 PCR鉴定［J］.中国病原生物学杂志，2008，3(8):574-576.
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