赵希
（环境学院 2013级本科 资源与环境经济学专业）
摘 要：作为广泛应用的抗虫类转基因植物的外源基因来源之一，苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis, 以下简称Bt）自从1901年被成功从昆虫尸体中分离以来的这100多年内，科学家们已经详尽的研究过其有效成分、生物机理、遗传特性、以及商品化等方面。以Bt为有效成分的杀虫剂，是目前世界上应用最为广泛的，产量最大的生物杀虫剂。因为Bt生产的杀虫毒蛋白有着高度的特异性与专一性，所以它一直被认为是一种对人非常安全的生物杀虫剂。因而在转基因技术发明以来，Bt一直是应用第二广泛的转基因外源基因来源，仅次于耐除草剂基因。本文将从对Bt的研究历史出发，介绍Bt毒蛋白的作用机理以及相关的转基因技术原理，并利用这些原理探讨转Bt基因农作物的生物作用效应，重点分析转Bt基因农作物的生态影响，最后针对其负面影响提出一些简单的解决方案。本论文以作者的高中和大学本科生物学以及生态学学习为理论基础，参考了国内外大量针对转Bt基因的研究以及转基因技术的综合研究相关文献，综合了对Bt和转基因技术的个人见解，对转Bt基因技术的以及其生态影响 进行了分析与讨论。
关 键 词：苏云金杆菌，Bt，杀虫蛋白，转基因，生物安全性，基因漂移，土壤微生物，生物多样性，抗性效应
一.Bt的研究历史及其杀虫机理
1.Bt的研究历史
苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，为昆虫病原细菌，其菌体为短杆状、有鞭毛，一般单生或形成短链。在芽孢形成期可产生具有杀虫活性的伴孢晶体且伴孢晶体(原毒素)对鳞翅目或双翅目等多种昆虫具有毒杀活性[1] 。1901年，日本学者石渡繁胤从虫尸体液中分离出苏云金杆菌猝倒变种，成为苏云金杆菌研究的起点。1911年，Berliner发现一种杆菌，并详细描述了该菌的形态和培养特征，定名为苏云金杆菌，指明苏云金杆菌含伴孢晶体。1938年，苏云金杆菌实现商品化，用于防治地中海粉螟。20世纪50年代许多国家进行了商业性生产。1981年，Schnept和Whitely首次将HD21菌株伴孢晶体的基因克隆到大肠杆菌中，并得到表达。这被视为转基因技术的开始。我国
对苏云金芽孢杆菌的研究和应用起步较晚，但发展迅速，据统计，在在70年代，我国苏云金杆菌制剂年产量大1000吨以上，并且部分产品用于出口[2]。
2.Bt的作用机理
苏云金杆菌在芽孢形成时期，会产生具有高度特异性杀虫活性晶体蛋白。这种晶体蛋白常常以原毒素形式存在。昆虫进食含有原毒素的食物后，在昆虫消化道内，在中肠消化酶的作用下，原毒素会被降解成多肽。此时原毒素的毒性会被激活，变成活化毒素。活化毒素会与昆虫肠道上皮细胞上的特异性受体结合，使肠道上皮细胞细胞膜破裂，进而导致昆虫进食困难从而达到杀灭昆虫的目的。
二.转Bt基因的原理及其相关应用
1.Bt基因的转基因原理
目前科学家普遍接受将Bt毒蛋白的基因，按照其氨基酸序列的同源性、抗原性和杀虫效力分为CryI，CryII和CryIII三种。转基因的第一步是分离目的基因。通常利用的方法是化学合成和PCR扩增技术。转Bt基因通常利用PCR扩增，因为目的基因已经存在且比较容易获取。
扩增之前先使用限制性核酸内切酶将目的基因序列从Bt的DNA序列上切下，获得目的基因链。通常获取的目的基因为CryI和CryIII。通过PCR技术大量合成目的基因。接下来将目的基因导入质粒。质粒是一种广泛存在于细菌细胞中，独立于染体之外的可以自行复制的双链DNA。对质粒进行遗传改造后，使其具有唯一的限制酶位点。然后利用限制酶切开质粒的DNA链，将目的基因导入质粒，形成新的DNA链。
将目的基因导入目标植物的方法通常分为间接导入和直接导入两种。间接导入是指通过农杆菌的Ti质粒介导，将目的基因导入目标植物。直接导入是Bt转基因技术通常使用的方法，效率高而且成功率高。我国目前使用的直接导入法是花粉管通道法。它是指直接将目的基因导入植物尚未具有细胞壁的卵、合子或早期胚胎中，完成目的基因的导入。
2.转Bt基因的相关应用
目前转Bt基因的应用范围非常广泛，在食品和非食品领域都有应用，如棉花、玉米和水稻。2001年，全球种植转Bt基因作物7.8×10^6 hm2，Bt抗虫与除草剂耐性集合形状转基因作物4.2×106 hm2，分别占转基因作物总播种面积的15%和8%，尤其转Bt基因玉米的面积最大，达到了5.9×106 hm2 ，占转基因作物总面积的11%脉搏测量仪[3]。在国内，截止2011年，转基
因棉花的种植量已经达到了总种植量的71.4%[4]。其中大部分棉花应用了转Bt基因技术。国内尚未批准任何玉米及水稻的转基因作物种植，因此目前有关中国种植或者销售玉米和水稻的转基因食品的报告均属于谣言。
三.转Bt基因的生物安全性
通过前文的论述，我们已经了解了转Bt基因的作用机理。接下来我们将会讨论Bt基因针对不同生物个体的影响，从而了解转Bt基因的生物安全性。
1.转Bt基因对目标昆虫的杀伤作用
由于Cry蛋白不像化学农药那样通过接触杀虫，而必须通过摄入靶标害虫的体内，被靶标害虫的碱性肠道内的蛋白酶激活。被激活的毒素结合到昆虫中肠上皮细胞的特异性受体为电商，并在细胞膜上形成膜孔，使得中肠细胞溶解、电解质失衡，引发败血症，最后导致目标昆虫的死亡[5]。转Bt基因产生的Cry毒蛋白对目标昆虫具有很强的杀伤作用。Cry毒蛋白针对靶昆虫可以说是致命的。
2.转Bt基因对非目标生物个体的作用
不同Bt杀虫蛋白具有不同的杀虫谱，所以转基因植物中的不同Bt基因表达必然对鳞翅目、鞘翅目、双翅目、膜翅目等多种非目标昆虫产生影响。这种影响程度取决于昆虫对Bt杀虫蛋白的敏感程度及转基因植株中杀虫蛋白的表达程度[6]。中国学者吴孔明先生的研究表明种植转Bt基因的棉田中，棉蚜虫的天敌数量居然得到了大幅增加。这增加了棉田自身抗虫能力[7]。大多数情况下，转CryI蛋白对稻田节肢动物落功能团组成及结构无明显负面影响[8]。而有研究表明，家蚕取食用Bt基因水稻花粉处理的桑叶后，对其致死率没有太大的影响，但对其体重和中肠细胞亚显微结构有一定的影响。但是上述实验室室内处理计量，实际稻桑工作环境下家蚕接触花粉的剂量远远小于室内处理剂量。针对体内没有特异性受体的生物，目前尚未有任何有毒性反应的报告。这与人们对蛋白质的特异性的了解基本吻合。因此，除了含特异性受体的昆虫以外，其他生物个体均不会受到任何不良影响。
3.转Bt基因对个体人类的作用
下地岛针对小鼠的实验表明，，一个成年人必须在一天内食用90 万kg 的未做熟Bt 转基因玉米，才能达到相当于对小鼠进行急性毒性试验所使用的等同剂量的Cry1Ab 蛋白( 4 000 mg /kg)。大量的综述文章总结了Bt 微生物杀虫剂及单独的Cry 蛋白的动物毒理学结果，而Bt
微生物产品和转基因Bt 作物长期的安全使用记录也支持Cry蛋白具有安全性的结论。在早期的Bt 微生物安全评估实验中，人类志愿者每天口服了1010 个Bt 孢子，呼吸道吸入了10学院9 个Bt 孢子并连续服用5 d，而没有不良反应发生剧本杀成社交新潮流[5]。
四.转基因的生态效应
1.正面生态效应
转基因作物，尤其是抗虫类转基因作物，其优良的抗虫特性可以大大减轻农药的使用压力。据现有的一些调查研究表明，转Bt基因抗虫没有对水稻稻田中的自然生态落产生负面影响。相反，由于它减少了对农药的使用，水稻田生态落的生物多样性得到了维护。甚至有研究表明，转Bt基因水稻稻田中的非靶标节肢动物数目得到了提升，尤其在水稻黄熟期能显著提高稻田中捕食性节肢动物亚落的数量，在成熟收割前期能显著提高稻田中捕食性亚落的物种丰富度[10]。因此，转Bt抗虫基因有一定的正面生态效应。
2.负面生态效应
1.1药品不良反应监测系统基因漂流
基因漂流是指一种生物体的基因通过某种媒介转移到另一种生物体内的过程。针对植物有三种基因漂流模式，花粉介导，种子介导和无性繁殖器官介导[12]。基因漂流的影响主要表现在一下三个方面：第一，外源基因可能会被野生植物的基因污染，导致转基因作物种子纯度下降。第二，外源基因转移到野生近源种的基因中，导致野生近源种产生基因变异，出现不可控制的生态问题。第三，外源基因转移到杂草中，导致杂草具有抗虫抗病抗逆形状，形成超级杂草，造成生态灾难[11][12]。
1.2土壤微生物
转Bt 基因作物的Bt 毒素可通过根系分泌物，残茬分解或秸秆还田以及花粉飘落进入土壤生态系统。进入土壤的Bt毒素可以吸附在土壤活性颗粒表面与之紧密结合避免生物降解，并保持八个月的杀虫活性[3]。转Bt 作物的长期种植可能会使Bt在土壤中富集，影响土壤的生态活性、生物多样性和各种生态过程。而且这些Bt毒素还可能通过降雨渗入地下水系，也可能通过雨水的冲刷作用污染地表水。Bt毒素对土壤中的非目标生物，对水系中的各种生物的影响还没有得到充分的调查研究，但是它已经引起了科学家们的注意。
1.3生物多样性
转入各种抗性基因的受体植物, 由于具有竞争优势而使其可以“入侵”到原本不能生存的生态空间, 造成严重的草害。插入到植物中的杀虫或杀真菌的基因也可能对非目标生物起作用,从而杀死有益的昆虫或真菌。转基因作物作为外来品种进入自然生态系统，可能影响植物基因库的遗传结构，致使物种呈单一化趋势，导致生物多样性的丧失[14]。抗虫基因不仅直接作用于目标害虫，对非目标害虫也可能间接地产生伤害，进而对生物多样性产生影响。破坏生物多样性。历史已证明，大面积种植单一品种对于一个新品种与病虫害竞争是很脆弱的。多数生态学过程都有一个阀值, 低于或超过这个阀值, 生态过程就变成不连续的、混乱的, 甚至会最后造成生态过程终止。企图帮助或过于偏爱某一种生物必然会伤害到另一些生物。而一个物种的灭绝, 可能会引起数十个物种甚至上百个物种的消亡。生态系统复杂性破坏, 系统抗干扰能力降低, 会造成生态系统的崩溃, 从而减少生态系统多样性[13]。
1.4靶标生物的抗性进化
血竭提取物
目前大量研究已经证实，转Bt基因的杀虫效果在逐渐下降。国内很多转基因抗虫棉田已经出现了一定规模的减产。而在国外很多转基因种植的大田表现并没有预期中的理想，杀虫剂的再次使用也是一个严重的问题。上述问题的原因有很多，包括种子还有基因漂流
造成的基因污染等。但是靶标生物的抗性进化也是很重要的原因。由于单一的杀虫毒素的持续表达，转Bt 植物对害虫的选择压力甚至比Bt 杀虫剂还要高，因而害虫很有可能以更快的速度进化出对Bt 的抗性[14]。Bt 基因在植物体内的持续表达，使得害虫在整个生长周期都受到Bt 杀虫蛋白的选择，可促使害虫对转抗虫基因植物产生相应的抗性。害虫对转基因植物的抗性发展，能够削弱转基因植物本身的效益，对环境产生负面影响，可能会导致杀虫剂的再次大量使用。
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