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超高效液相谱-串联质谱法测定人血清中4种镇静催眠类药物

Vol. 30， No. 4

Apr. 2021

化学分析计量

CHEMICAL ANALYSIS AND METERAGE

第30卷，第4期2021 年 4 月

doi ： 10.3969/j.issn.1008-6145.2021.04.009

超高效液相谱-串联质谱法

测定人血清中4种镇静催眠类药物

于浩洋，李颜岩，冯静，华正罡

（辽宁省疾病预防控制中心，沈阳110005）

摘要建立超高效液相谱-串联质谱法测定人血清中氯氮平、氟醇、氟奋乃静、丙咪嗪4种镇静催眠类药

物的方法。样品经乙腈提取，采用ACQUITY UPLC HSS T3谱柱分离，以乙腈-水溶液(含0.05%甲酸)为流动

相梯度洗脱，流量为0.3 mL /min ，进样体积为10 “L，多反应监测模式检测。4种镇静催眠类药物在各自的质量浓

度范围内与谱峰面积具有良好的线性关系，相关系数均大于0.995，氯氮平、氟醇、丙咪嗪的检出限均为0.03

“g /L，氟奋乃静的检出限为0.06 “g /L 。测定结果的相对标准偏差为1.1%〜8.9% (n =6)，加标样品平均回收率为

防水混凝土施工技术90.7%〜111.9%。该方法准确、可靠，适用于人血清中镇静催眠类药物的检测。

关键词超高效液相谱-串联质谱法；人血清；镇静催眠类药物

中图分类号： O657 文献标识码： A 文章编号： 1008-6145(2021)04-0038-04

Determination of four sedative hypnotic drugs in human serum

by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

Yu Haoyang, LI Yanyan, Feng Jing, Hua Zhenggang

(Liaoning Center for Disease Control and Prevention, Shenyang 110005, China)

Abstract A method for the determination of clozapine, haloperidol, fluphenazine and imipramine in human serum by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was established. The sample was extracted with

acetonitrile and separated on acquity UPLC HSS T3 column. The mobile phase was acetonitrile water solution(containing

0.05% formic acid) with gradient elution. The flow rate was 0.3 mL / min and the injection volume was 10 j L. The multi reaction monitoring mode was used for detection. There were good linear relationships between the four sedative

hypnotic drugs concentration and the chromatographic peak area in their respective concentration range, and the correlation

coefficients were all more than 0.995. The detection limits of clozapine, haloperidol and imipramine were 0.03 j g /L, and the detection limit of fluphenazine was 0.06 j g /L. The relativ

e standard deviation of the results were 1.1%-8.9%(n =6),

and the average recoveries of spiked samples were 90.7%-111.9%. The method is accurate, reliable and suitable for the determination of sedative and hypnotic drugs in human serum.

Keywords ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; human serum; sedative hypnotic drugs

随着生活节奏日益加快、竞争日益加剧，越来越多的人产生焦虑障碍，从而给当今人类的身心健

康造成严重威胁。焦虑是人们生活中产生的一种正常的生理反应，而焦虑、紧张过度或出现某些病理

性焦虑时称为焦虑障碍。焦虑障碍会使患者的生活质量和社会功能下降，还会引发躯体功能障碍，导

致其它疾病的发病率升高⑴。其中焦虑和失眠是较为常见的症状，也是各型神经症的中心症状。镇静诡辩论

催眠药是一类中枢神经系统抑制药，第1代镇静催眠药为类药，其不良反应大，抑制呼吸，过量

可致死，安全范围小，易蓄积中毒，有明显潜在的成瘾性。目前临床应用广泛的是第2代镇静催

简述人民主权理论的主要内容

通讯作者华正罡，副主任技师，主要研究方向为食品污染物风险监测.159****************收稿日期2021-01-28

引用格式于浩洋，李颜岩，冯静，等.超高效液相谱-串联质谱法测定人血清中4种镇静催眠类药物[J ].化学分析计量,2021,30(4): 38.

Yu Haoyang, LI Yanyan, Feng Jing, et al. Determination of four sedative hypnotics drugs in human serum by ultra performance liquid

chromatography-tandem mass spectrometry [ J ] . Chemical Analysis and Meterage ， 2021， 30(4): 38.

于浩洋，等：超高效液相谱-串联质谱法测定人血清中4种镇静催眠类药物39

眠类药物⑵，其具有较强的多巴胺受体和5-羟胺受体阻断作用⑶，主要包括氯氮平、氟哌定醇、氟奋乃静、丙咪嗪等。氯氮平为二苯二氮卓类抗精神病药，是一种新型广谱抗精神病药物，对脑内5-羟胺(5-HT2A)受体和多巴胺(DA1)受体的阻滞作用较强，吸收迅速；氟醇是一种典型丁酰苯类抗精神分裂药，有较强的多巴胺受体拮抗作用，主要用于多种急、慢性精神分裂症、躁狂症、抽动秽语综合症⑷；盐酸氟奋乃静属于吩噻嗪类药物，具有较强的抗精神病作用和轻度的镇静作用；丙咪嗪为三环类抗抑郁药，有较强的抗抑郁作用。

适量服用镇静催眠类药物可改善患者焦虑障碍症状和生活质量，服用过量则会引起严重的椎体外系症状(EPSs)⑸。近年来因该药物服用过量引起的急性中毒事件发生率很高⑹。中毒程度与药物种类、血药浓度密切相关，迅速定性、定量检测中毒患者的血药浓度对临床抢救具有重大意义［7-9］o 目前测定镇静催眠类药物的方法主要有高效液相谱(HPLC)法［10-12气相谱-质谱(GC-MS)法［13-14］以及液相谱-串联质谱(LC-MS/MS)法［15-16］o HPLC法的灵敏度和特异性相对较低，无法适应高灵敏度要求的中毒样本血药浓度检测; GC-MS法不适合检测难挥发、热稳定性差的镇静催眠药；LC-MS/MS法的多通道检测可一次性检测多种化合物且无干扰，可缩短分析时间，灵敏度比GC-MS法高。目前大多数高效液相谱-串联质谱法的前处理采用液液萃取或固相萃取等方式，操作繁琐，耗时长，样本用量大，无法适应中毒样本快速定性定量的要求。笔者建立一种以乙腈沉淀蛋白的HPLC-MS/MS法同时测定人血清中氯氮平、氟醇、氟奋乃静和丙咪嗪的浓度，操作简单，可快速测定已中毒患者的血药浓度。

1实验部分

1.1主要仪器与试剂

超高效液相谱-串联质谱仪:Acquity Xevo TQ型，美国沃特世公司。

涡旋振荡器:Lab Dancer型，德国艾卡公司。

高速冷冻离心机:Thermo ST16R型，美国赛默飞世尔公司。

氯氮平标准物质：纯度不小于99.6%，标准物质编号为CCHM701181，美国CATO公司。

氟醇标准物质：纯度不小于99%，标准物质编号为CDCT-C13801600，德国Dr.Ehrenstorfer 公司。

盐酸氟奋乃静标准物质：纯度不小于99%，编号为CDCT-C14059400，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

丙咪嗪标准物质：纯度不小于99%，编号为CDCT-C13402100，德国Dr.Ehrenstorfer公司。

乙腈：谱纯，美国费希尔公司。

甲酸：优级纯，北京化工厂有限责任公司。

血清样品来自于辽宁省疾病预防控制中心。

实验用水为超纯水。

1.2仪器工作条件

1.2.1谱条件

谱柱：ACQUITY UPLC HSS T3谱柱(100 mm x2.1mm,1.8j m，美国沃特世公司)；柱温：40 r；样品室温度：4r；流动相：a相为乙腈，b相为0.05%甲酸溶液，流量为0.3mL/min；梯度洗脱程序见表1；进样体积：10j L o

表1梯度洗脱程序

时间/min

体积分数/%

乙腈0.05%甲酸溶液初始3070

0.53070

1.57030

3.57030

4.03070

6.03070

1.2.2串联质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI+)；毛细管电压: 2.64kV；离子源温度：350r；脱溶剂气流量：650 L/min；4种镇静催眠类药物质谱参数见表2o

表24种镇静催眠类药物的质谱参数

化合物

母离子

(m/z)

子离子(m/z)

碰撞能量/

锥孔电压/

保留时间/

min

氯氮平327.29270.231)/192.024/4432 1.95

氟醇376.36165.051)/123.0524/4234 1.70

电子产品世界氟奋乃静438.40171.171o/143.1126/3238 1.90一机双号

丙咪嗪281.35193.191)/208.2338/2424 2.02注：1)表示该离子用于定量检测。

1.3样品预处理

移取100j L血清样品于3mL离心管中，加入300j L乙腈，震荡涡旋3min，以15000r/min离心15min，取上清液250j L，加入250j L水，涡旋均匀，过0.22j m滤膜，待测。

1.4溶液配制

标准储备溶液：分别准确称取4种镇静催眠药物标准物质，用乙腈溶解，配制成盐酸氟奋乃静、氟

40化学分析计量2021年，第30卷，第4期

醇、氯氮平、丙咪嗪的质量浓度分别为0.732、0.802、1.115、0.8888mg/mL的4种镇静催眠药的单一标准储备溶液。

混合标准储备液：分别移取适量4种镇静催眠药标准储备溶液于10mL容瓶中，用乙腈定容至标线，配制成盐酸氟奋乃静、氟醇、氯氮平、丙咪嗪的质量浓度分别为0.55、1.20、31.36、35.55i g/mL 的混合标准储备溶液，于-20r下保存。

系列混合标准工作溶液：分别吸取适量混合标准储备溶液于适量乙腈中，配制成系列混合标准工作溶液，于-20r下保存,4种镇静催眠药的质量浓度见表3。

表3系列混合标准工作溶液中各化合物的质量浓度u g/mL 化合物123456

氯氮平0.78 1.57 3.1410.4520.9131.36氟醇0.030.060.120.400.80 1.20

氟奋乃静0.0140.0270.0550.180.370.55丙咪嗪0.89 1.68 3.5611.8523.7035.55基质系列标准工作溶液：准确吸取90i L血清，分别加入10i L系列混合标准工作溶液，得4种镇静催眠药的质量浓度见表4，按1.3处理后得基质系列标准工作溶液。

表4基质系列标准工作溶液中各化合物的质量浓度ng/mL 化合物123456氯氮平26.1352.26104.53348.44696.881045.31氟醇 1.00 2.00 4.0113.3726.7340.10氟奋乃静0.460.9

2 1.83 6.1012.2018.30丙咪嗪29.6359.25118.51395.02790.051185.07 2结果与讨论

2.1质谱条件优化

4种镇静剂均属于含有氮原子的碱性化合物，适用于ESI正离子模式扫描，可获得丰度较高的[M+H]+母离子，采用离子扫描方式选择响应最大的两个碎片作为子离子，确定定量离子对和定性离子对，并对碰撞能量等质谱条件进行优化。优化的质谱参数见表2。

2.2谱条件优化

杜华瑾4种化合物均采用正离子模式进行扫描，在流动相中加入适量甲酸有利于化合物的电离，可提高离子响应。分别考察0.05%、0.1%、0.15%甲酸溶液对测定结果的影响。结果表明，在上述3种浓度甲酸溶液下4种化合物的峰形与响应值均未见显著性差异，最终选择0.05%甲酸溶液作为流动相。

当样品溶液的溶剂强度高于流动相溶剂强度时，易造成峰展宽、峰分叉现象。采用乙腈提取血清样品，按照乙腈与水体积比为1：1加入水，混匀后进样测定，可有效防止溶剂效应、改善峰形以及提高响应值。

2.3前处理条件优化

蛋白质沉淀是一种较为常用的样本前处理方法，能防止谱分析过程中谱柱的堵塞和质谱分析过程中的离子源污染。分别采用乙腈、乙醚、二氯甲烷沉淀血清中蛋白质。由于乙醚与二氯甲烷不可作为溶剂直接上机进样，因此采用乙醚和二氯甲烷沉淀蛋白后，分别于40r水浴氮气吹干，用乙腈-水(1+1)溶液复溶后进样。试验结果表明，采用二氯甲烷沉淀蛋白的回收率低于乙腈与乙醚，用乙醚沉淀时需要氮气吹干再复溶，操作繁琐，与急性中毒患者快速定性、定量的诉求相悖，因此最终选择乙腈沉淀蛋白。

2.4线性范围的设定

根据各药物有效血药浓度设定其线性范围。根据神经精神药理学与药物精神病学协会(AGNP)药物监测(TDM)专家组指导方案，推荐氯氮平的有效浓度为350-600i g/L[17]；于欣等[18]通过对既往有关氟醇精神分裂症浓度-效应分析，提出氟醇精神分裂症合宜的血药浓度为2.7-22.7i g/L；盐酸氟奋乃静血药浓度参考值范围为0.6-2.4i g/L[19]；丙咪嗪为三环类抗抑郁药，一般认为各三环类抗抑郁药的中毒浓度均不低于500i g/L[20]。线性范围包含有效血药浓度范围，线性范围最高浓度包含实验室警戒浓度，最终设定氯氮平为26.1-1045.3i g/L，氟醇为1.0-40.1i g/L，盐酸氟奋乃静为0.5-18.3i g/L、丙咪嗪为29.6-1185.1i g/L。

2.5线性方程和检出限

在1.2仪器条件下，测定1.4配制的基质系列标准工作溶液，以待测化合物的谱峰面积(y)为纵坐标，质量浓度(x)为横坐标绘制标准工作曲线。以3倍信噪比对应的浓度作为方法检出限。4种镇静催眠类药物的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表5o

表5线性范围、线性方程、相关系数及检出限

化合物

线性范围/

(i g-L1)

线性方程