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还原糖和总糖的测定方法

还原糖和总糖的测定——3,5-二硝基水杨酸比法

一、材料、主要仪器和试剂

1、材料小麦面粉；精密pH试纸。

2、主要仪器

（1）具塞玻璃刻度试管：20mL×11 （2）大离心管：50mL×2

（3）烧杯：100mL×1 （4）三角瓶：100mL×1

（5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度吸管：1mL×1；2mL×2；10mL×1

（7）恒温水浴锅（8）沸水浴

（9）离心机（10）分光光度计

3、试剂

（1）1mg/mL葡萄糖标准液

准确称取80℃烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4℃冰箱中保存备用。

（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂

将6.3gDNS和262mL2MNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕瓶中备用。

（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。

（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL70%乙醇中。

（5）6MHCl和6MNaOH各100mL。

二、操作步骤

1．制作葡萄糖标准曲线

取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。

表1葡萄糖标准曲线制作

贺知章

管号	1mg/mL 葡萄糖标准液（mL）	附庸蒸馏水（mL）	DNS （mL）	葡萄糖含量成都江汉路（mg）	光密度值（OD540nm）
0	0	2	1.5	0 男男
1	0.2	1.8	1.5	0.2
2	0.4	1.6	1.5	0.4
3	0.6	1.4	1.5	0.6
4	0.8	1.2	1.5	0.8
5	1.0	1.0	1.5	1.0
6	1.2	0.8	1.5人宇科学	1.2

将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加

塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比。调波长540nm，用0号管调零点，测出1~6号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。

2．样品中还原糖和总糖的测定

（1）还原糖的提取

中共二大

准确称取3.00g食用面粉，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉淀）转移到50mL离心管中，于4000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。

（2）总糖的水解和提取

准确称取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL6MHCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却

后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。

（3）显和比

取4支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比等其余操作与制作标准曲线相同。

表2样品还原糖测定

管号	还原糖待测液（mL）		总糖待测液（mL）		蒸馏水（mL）		DNS （mL）		光密度值（OD540nm）	查曲线葡萄糖量（mg）
7		0.5				1.5		1.5
8		0.5				1.5		1.5
9				1		1		1.5
10				1		1