（3、5——二硝水杨酸比法）
目的和要求：
1．掌握3、5-二硝基水杨酸比法测定糖量的原理及方法。
2．熟悉722分光光度计基本工作原理和操作方法。
原理：
各种单糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用溶解度不同，可将植物样品中的单糖、双糖和多糖分别提取出来，再用酸水解法使没有还原性的双糖和多糖彻底水解成有还原性的单糖。
在碱性条件下，还原糖与3、5—二硝基水杨酸共热，3、5—二硝基水杨酸被还原为3-氨基-5-硝基水杨酸（棕红物质），还原糖则被氧化成糖酸及其它物质。
在一定范围内，还原糖的量与棕红物质颜深浅的程度成一定的比例关系，可在分光光度计540nm波长测定棕红物质的吸光值。查标准曲线计算，便可分别求出样品中还原糖和总糖的含量。 多糖水解时，在单糖残基上加了一分子水，因而在计算中须扣除已加入的水量，测得所得到的总糖量乘以0.9即为实际的总糖量。
该方法是半微量定糖法，操作简便，快速，杂质干扰较少。
1．试剂
（1）1mg/ml葡萄糖标准液：准确称取100ml分析纯葡萄糖（预先在105℃烘至恒重），置于小烧杯中，用少量蒸馏水溶解后，定量转移到100ml容量瓶中，以蒸馏水定容到刻度，摇匀，冰箱中保存备用。 （2）3、5—二硝基水杨酸试剂（又称DNS试剂）
甲液——溶解6.9g结晶酚（苯酚）于15.2ml 10%NaOH中，并稀释至食品广告管理办法69ml，在此溶液中加入6.9g亚硫酸氢钠。
乙液——称取22.5g酒石酸钾钠，加到300ml 10% NaOH中，再加入880ml 1%的3、5—二硝基水杨酸溶液。
将甲液和乙液相混合即得黄试剂，贮于棕试剂瓶中，放置7—10天使用。
（麦迪霉素3）碘—碘化钾溶液（碘试剂）：称取5g碘和10g碘化钾，研匀后溶于100ml蒸馏水中。
（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞溶于70%乙醇中。
（5）6 mol·L-1 HCl
（6）6 mol·L-1NaOH
（7）面粉
2．器材
比管、离心管、量筒、三角瓶、容量瓶、刻度吸管、玻璃漏斗、滤纸、白瓷板、
电热恒温水浴槽、离心机、天平、分光光度计。
操作步骤：
1．标准曲线的制作
取6支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确浓度为1.00mg/ml的葡萄糖标准液和3、5—二硝基水杨酸试剂。
管号 加入试剂 | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
葡萄糖标准液（ml） | 0 | 0.4 | 0.6 | 0.8 | 1.0 | 1.2 |
蒸馏水（ml） | 3.5 | 3.1 | 2.9 | 2.7 | 2.5 | 2.3 |
3、5—二硝基 水杨酸试剂（ml） | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
总体积（ml） | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| | | | | | |
将各管摇匀，带上小漏斗，在沸水浴中加热5min，立即用冷水冷却至室温，再向各管中加入蒸馏水20.0ml，用橡皮塞塞住管口，颠倒混匀。切勿用力振摇，引入气泡。在540nm波长下，以0号管为空白，在分光光度计上测定1-5号管的吸光值。以吸光值为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标，绘制标准曲线。
2．样品中还原糖和总糖含量的测定
(1) 样品中还原糖的提取：
称取2.00g左右在常温下于干燥器内保存数日的面粉，置于125ml三角瓶中，以少量水调成糊状，再加入40ml蒸馏水，搅匀，置于50℃恒温水浴中保温20 min。其间间或振荡，使还原糖浸出。
将上液倒入100ml容量瓶中，用少量的蒸馏水多次洗涤三角瓶内残留物，将所得的洗涤液全部收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。
取适量上液于离心管中，在3500转/分下离心10分钟。上清液作为还原糖待测液。
(2) 样品中总糖的水解和提取：
称取0.80g左右同样的面粉，置于125ml三角瓶中，加入15ml蒸馏水，10ml 6 mol·L-1的HCl，在沸水浴中加热30 min。用滴管取1-2滴于白瓷板上，加1滴碘-碘化钾试剂，若不显蓝，表明水解完全。
将瓶中水解液冷却，加入1滴0.1%的酚酞指示剂，用6 mol·L-1NaOH中和至微红。然后
将上溶液倒入100ml容量瓶中，并用少量的蒸馏水多次洗涤三角瓶内的残留物，将所得的洗涤液全部收集于100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀。
取适量上液于离心管中，在3500转/分下离心10分钟 ( 或过滤于干燥的三角瓶中，弃去前几毫升滤液，得滤液约15ml)；准确吸取其上清液10.0ml，再定容至100ml，作为总糖的待测液。
取5支干燥试管，编号，按下表所示的量，精确加入待测液和试剂：
管号 项目 | 东海小哨兵空白 | 还原糖 | 总糖 |
0 | 1 | 2 | 雷州市附城中学4 | 5 |
样品量（ml） | 陈独秀身世婚恋后代 0 | 2.0 | 2.0 | 1.0 | 1.0 |
蒸馏水（ml） | 3.5 | 1.5 | 1.5 | 2.5 | 2.5 |
3、5—二硝基水杨酸(ml） | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
总体积（ml） | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 | 5.0 |
| | | | | |
加完试剂后，其余操作步骤与制作葡萄糖标准曲线时的相同，测定出各管溶液的吸光值。
计算：
以管1、2、3的吸光值的平均值和管4、5、6的吸光值的平均值，分别在标准曲线上查出相应的还原糖毫克数，按下式计算样品中还原糖和总糖的百分含量：
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提取液总体积
标准曲线上查得的还原糖毫克数×
思考题
(1) 若要获得较为理想的标准曲线，操作时应注意哪些问题？
(2) 比测定时为什么要设空白管？
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