CHO有限稀释法步骤
1. 简介
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CHO有限稀释法（Chinese Hamster Ovary Limited Dilution）是一种常用的细胞培养技术，用于分离和纯化CHO细胞。CHO细胞是一种常用的哺乳动物细胞系，在生物医药领域中广泛应用于生产重组蛋白和抗体等生物药物。CHO有限稀释法通过将初始的CHO细胞悬浮液进行多次有限稀释，使得每个培养皿中只存在一个单独的细胞，从而实现单克隆的分离和纯化。 本文将详细介绍CHO有限稀释法的步骤，并提供相关操作注意事项。
2. 步骤
2.1 准备工作
•清洁和消毒培养器具，如培养皿、移液器、离心管等。
•预先准备好所需的培养基和试剂。
•购置或制备所需的CHO细胞悬浮液。
2.2 稀释过程
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1.取出初始的CHO细胞悬浮液，并使用显微镜观察其形态和健康状态。2.将CHO细胞悬浮液进行适当的稀释，以使得每个培养皿中含有的细胞数目较少。通常，初始的稀释比例为1:10至1:1000。
3.将稀释后的CHO细胞悬浮液均匀地分装到培养皿中。注意避免气泡的产生。
4.放置培养皿在恒温培养箱中，设置适当的温度和CO2浓度，并进行培养。
2.3 单克隆分离
5.在培养过程中观察细胞生长情况，通常需要5-7天时间才能观察到单个细胞形成的克隆。
6.使用显微镜观察培养皿中的细胞聚集情况。选择一个只含有一个单独细胞的聚集体（colony）。
7.使用移液器将该聚集体转移到新的培养皿中，并加入适当的培养基。
8.继续进行培养，直至新的聚集体形成。
2.4 纯化和扩增
9.地牢围攻3联机重复上述单克隆分离步骤，直至获得所需数量的单克隆。
10.对每个单克隆进行细胞形态和生长特性的观察，并选择具有理想特性的单克隆进行纯化和扩增培养。
11.使用离心技术将细胞沉淀，去除上清液。
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12.加入适当的培养基和试剂，将细胞重新悬浮，并分装到新的培养皿中。
13.继续进行培养和扩增，直至获得足够数量的CHO细胞。
3. 注意事项
•在操作过程中要注意无菌操作，避免细菌和其他微生物污染。
•培养皿、移液器等工具要经过严格清洁和消毒处理，以确保实验结果的准确性。
•选择健康、形态良好且生长活跃的CHO细胞作为初始悬浮液。
•在稀释过程中要注意均匀地分装细胞悬浮液到培养皿中，避免气泡产生影响结果。
杠杆舞•观察培养过程中细胞生长情况时要耐心，通常需要较长时间才能观察到单个细胞形成的克隆。
•在分离和纯化过程中，要选择具有理想特性的单克隆进行扩增培养。
•细胞悬浮液的保存和传代应按照相关规范进行，避免细胞的变异和污染。
通过CHO有限稀释法，可以高效地分离和纯化CHO细胞，为后续的生物药物生产提供可靠的基础。在实际操作中，需要严格控制每个步骤的操作技巧和条件，以确保实验结果的准确性和可重复性。
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