2012-10-10 DMEM/F12培养基配制 gibco D-MEM/F-12 CAT.NO.12500-062 LOT.NO.1206536 干粉培养基,每包装配1L。 直接溶于1L纯净水中,加2.438g碳酸氢钠,搅拌2小时,pH试纸检测中性。 0.22μm滤器过滤180ml培养基入250ml血清瓶。 5瓶180ml,1瓶不到180ml。 其中1瓶180ml生物工程学报培养基加入FBS 20ml。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-11 CHO-S细胞复苏: 41℃迅速溶解1min; 2ml细胞液+6ml DMEM/F12 10%FBS加入离心管,轻柔吹散。 离心1000rpm 5min; 弃上清; 加入3ml DMEM/F12 10%FBS,轻柔吹散,加入75ml细胞方瓶,补3ml DMEM/F12 10%FBS; 37℃ CO2培养; | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-12 细胞观察: 贴壁,90%密度; 95%呈圆形,少量有梭型倾向,密度过高,决定传代; 细胞传代:13:00 弃上清; 加入胰酶,2滴管(37℃回温); 室温显微镜下观察,有微量脱落,1min; 倒出胰酶,加入5ml DMEM/F12 10%FBS,9区吹扫程序3次; 1传2,补2.5ml DMEM/F12 10%FBS; 原瓶中还有未脱落细胞,又加入5ml DMEM/F12 10%FBS继续培养,胶布标记。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-13 观察细胞状态: 贴壁,有少量呈梭型,大部分为原型,但并不圆润。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-15 观察细胞: 大部分为梭型,少量为原型,约80%,培养基开始变浅。 细胞传代: 两瓶量多的1传2; | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-16 观察细胞: 传代时分散不好的细胞过夜培养后镜下观察,成团状生长,有展开细胞。 换培养液:13:00 未脱落细胞换液,生长良好。 配PBS: NaCL 1.6g, KCL 0.04g, KH2PO4 0.04g, Na2HPO4.12H2O 0.726g, H2O 200ml, 高压灭菌。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-17 胰酶消化分散传代: PBS清洗2遍; 胰酶侵润,立即倾倒或保持; 显微镜下观察1min; 加入5ml培养基; 吹扫分散,1传2; | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-18 细胞观察: 尹骏传代的4瓶有2瓶没贴壁,我怀疑是第一次做的时候胰酶消化的时间过长,损伤了细胞壁;(需要严格控制消化时间,尤其注意,胰酶在倒出后,应立即加入终止培养基。) 我传代的6瓶贴壁生长正常,但还是有团块生长;(这种团块生长可能是第一次传代为吹匀所致,并不是第二次传代可以吹散的,计划降低接种比例,延长生长时间,逐步减少团块数量。) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-19 配制胰酶: life science进口分装胰酶; 0.25%,100mlPBS溶解; 0.22μm过滤; 冻存液配制: 5%DMSO,250μLDMSO,4750μL含血清培养基。 细胞冻存: 选密度较高,展开细胞较多,团块较少的4瓶细胞消化冻存; 倒掉培养基; 2ml胰酶,室温60秒静置; 倒掉胰酶; 加入5ml培养基,9区吹扫,液面下吹打80次; 1000rpm离心5min; 倒掉上清; 加入冻存液; 立即放入4℃,1h; -20℃,3h; 液氮口过夜; 装入液氮存储核; 6B41\6B42\6B34\6B22 其中有一只冻存管细胞较少,已标明。 细胞传代: 一瓶1传2; 一瓶1:4传代。 (新配的胰酶很好用,细胞容易打散) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-20 尹骏传代的两瓶贴壁不好的细胞今日换液,去除死细胞 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-21毕志强 细胞观察: 1:4传代的一瓶(原瓶)培养基变黄,细胞贴壁展开非常好,比其他几瓶都好,未见染菌。推测细胞展开良好,没有接触抑制,代谢旺盛,生长迅速。建议立即换液。 细胞换液: 1:4传代的一瓶(原瓶) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-22 细胞观察: 前日培养基颜变化很大的一瓶细胞,换液过夜后颜变化依然很大,并且细胞形态由展开向收缩发展,决定放弃。 细胞传代: 取三瓶细胞形态较好的1:4传代;共传6瓶,计划4瓶冻存,2瓶用于DNA提取; 使用吸管吹散,细胞分离不完全,见2-8个聚集。 培养基配制: 从马格非分装血清中分出80ml,其中20ml加入180ml培养基中待用,60ml储存。 细胞复苏: 尹骏复苏了2012-10-19冻存的细胞一只。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-24 细胞观察: 22日1:4传代细胞有聚集有展开,不是最佳状态,可能不适于冻存,原因可能是上次用吸管吹的力度比较小,为完全吹散; 按照罗成的建议可以适当这延长消化时间,尽量减少吹打的损伤; 胰酶消化和吹散哪种更损伤细胞? | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-25 细胞冻存: 冻存4只细胞(有一只打破了还剩3只) 冻存液配制: 10%DMSO,400μLDMSO,3600μL含血清(10%)培养基。 细胞冻存: 倒掉培养基; PBS漂洗2遍; 2ml胰酶,室温70秒静置; 倒掉胰酶; 加入5ml培养基,9区吹扫,液面下吹打80次; 1000rpm离心5min,弃上清; 加入1ml冻存液,迅速混匀; 4℃1h,-20℃2h,液氮口过夜(绳子太长了接触到液氮了),放入液氮存储盒里,连战祖籍6B34/6B22/6C23。 胰酶消化一瓶细胞,离心收集,用于全DNA提取。 | 2012-10-25 CHO-S全DNA提取: | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-26 细胞传代: 3ml吹扫,0.3:4.7接种; 1ml弹簧很松,吹打了110下,细胞基本分散; 传代4瓶。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-27 细胞复苏:19:00 2012-10-25冻存细胞(10%DMSO); 离心管加入4ml培养基; 细胞瓶加入2ml培养基: 取出冻存细胞,42℃水浴,快速震荡,至融化。 加入到含4ml培养基离心管; 离心1000rpm,1min; 弃上清; 加入5ml培养基,短暂吹打,重悬; 加入含2ml培养基细胞瓶,7ml过夜培养(加大对DMSO的稀释比例)。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-28 细胞观察:9:00 27日复苏细胞有30%贴壁,呈圆形,未展开,分布均匀; 26日传代细胞贴壁,50%展开,有少量悬浮,计划29日换液。 细胞换液: 对27日复苏细胞进行换液,为进一步降低DMSO影响。 | 2012-10-28 引物稀释: 8Lout加H2O 521μl稀释为10μM,分装3管10μl; 8Rout加H2O 636μl稀释为10μM,分装3管10μl。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-29 26日传代细胞观察: 26日传代细胞状态良好,展开率高。 27日复苏细胞观察: 27日复苏细胞基本没有分裂,形态介于展开间,形态异常 | 2012-10-29 Prime STAR PCR: buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA(10/25) 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-30 26日传代细胞冻存:3只 5B52/6B22/6C23 传代4瓶:0.5:4.5 | 2012-10-30 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-10-31 30日传代细胞观察: 有一瓶明显展开率偏低,还观察到一个异常的大细胞,内部有几个膨胀囊泡, 用白胶布做标记。 27日复苏细胞观察: 随生长缓慢,但以开始展开,未见悬浮死亡。 | 2012-10-31 电泳: 在500左右位置可见一相对高亮条带,但比较模糊,无法提取。见弥散性杂带,提高退火温度可以缓解。可条带貌似比500小,理论应该比500大。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-1 30日冻存细胞复苏: 30日传代细胞观察: 异常的那瓶细胞出现死亡现象,漂浮细胞明显增多; 计划下午三点对其余三瓶细胞换液。 27日复苏细胞观察: 细胞形态趋于正常。 | 2012-11-1 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-2 | 2012-11-2 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-3 30日传代细胞再传代: 8瓶,1传4比例,用于冻存,建立野生型细胞库。 | 2012-11-3 CHO-DNA提取: 1瓶细胞提2管,双倍的GB,70℃共40分钟,少量不溶胶状物用挑出,电泳可见条带。 Prime STAR PCR: buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA(11/3) 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 30s 58℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min 10/31的PCR显示特异性和效率不高,退火温度为52℃,本次11/4提高了退火温度到58℃,为见PCR条带,怀疑退火温度提高太大,引物Tm值为61到63℃,理论退火温度56℃。为了兼顾效率和特异性计划使用touchdown PCR。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-4 touchdown PCR 1: 95℃ 30s 2-14: 94℃ 30s 58℃-52℃ 30s 72℃ 30s 14-32: 94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 33: 72℃ 5min Prime STAR PCR: buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl 电泳未显示条带,发现有人将第二次基因组提取时用的乙醇换成了TIRS,正是第二次提取的DNA两次PCR都没有条带。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-5 10/30冻存11/1复苏转瓶: 消化,分散,全转新瓶。 | 2012-11-5 用第一次提取的DNA进行PCR,Prime STAR和Taq两组,touchdown PCR条件。 Prime STAR PCR: buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μl Taq PCR: Buffer 5μl MgCl2 5μl dNTP 8μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl CHO-S DNA 1μl Taq 1μl H2O 28μl 1: 95℃ 30s 2-14: 94℃ 30s 58℃-52℃ 30s 72℃ 30s 14-32: 94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 33: 72℃ 5min 目的条带亮度很低,与普通PCR条件相比目的条带附近杂带较少,而大分子量杂带较多。按照位置推算正确。做基因提取应该可以。考虑染体结构庞大复杂,建议延长变性时间。 条带回收: 第二轮Prime STAR PCR: 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-6 11/3传代细胞冻存: 7只,有一瓶培养基变黄,与其他7瓶颜明显不同,未见染菌,放弃; 使用HYCLONE南美血清配制培养基,用于分散离心,用原培养基配5%DMSO冻存; 由于处理量比较大,先消化分散,加入离心管,带都操作完统一离心,后发现在离心管中停留的时间太长,细胞重新贴壁,离心后堆积较少,仔细观察壁上细胞较多,加入DMSO培养基重悬,不敢过长时间吹打,冻存细胞密度可能偏低。 3C54 11/6, 5B52 11/6, 6B41 11/6, 6B42 11/6, 6B33 11/6, 6B34 11/6, 6C22 11/6 10/30冻存11/1复苏11/5全转新瓶细胞生长良好。 | 2012-11-6 回收: Taq PCR: Buffer 5μl MgCl2 5μl dNTP 8μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl FUT81μl Taq 1μl H2O 28μl 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-7 电泳:未成功 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-8 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-9 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-10 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-11 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-12 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-13 Taq PCR: Buffer 5μl MgCl2 5μl dNTP 8μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl FUT81μl Taq 1μl H2O 28μl 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 30s 52℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min | 2012-11-13 DH5α甘油菌200μl接种Amp LB 20ml 过夜37℃; | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-14 电泳: 切胶分离: 回收: 发现比预期小的位置还有一条带,看强度应该是扩增所得,prime STAR扩增未见,第一次Taq扩增也未见,也可能是第一次电泳条带太浅,怀疑是非特异性扩增。两条带都回收,计划都进行测序。 | 2012-11-14 DH5α保甘油菌; 制作平板AMP 4块(其中1块不含抗性,3块含AMP); 每块20ml 4块80ml LB Tryptone 0.8g Yeast expract 0.4g NaCl 0.8g 琼脂 1.6g DH5α平板划线,过夜37℃。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-15 pMD18-T载体连接: Solution I 5μl pMD18-T 1μl FUT8-A 4μl 16℃过夜连接 | 2012-11-15 从平板上挑DH5α单菌落接入20ml LB,37℃过夜培养。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-16(五) | 2012-11-16(五) 取200μl接入20ml LB,37℃1.5-3h培养。 4℃离心 6000rpm 5min。 弃上清。 600μl预冷0.1M CaCl2重悬。 冰浴30min。 4℃离心 6000rpm 5min。 弃上清。 100μl预冷0.1M CaCl2重悬。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-17(六) 转化: 8T5/8T3 10μl 感受太细胞 100μl 冰浴 30min 42℃ 90s 冰浴 2min LB 500μl 37℃ 1h 涂平板: 过夜培养。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-18 单克隆摇菌管: 过夜培养; | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-19 甘油菌:8T5A/B/C,8T3A 测序:结果异常 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-20 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-21 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-22 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-23 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-24 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-25 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-26 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-27 新设计的引物:8LoutB,8RoutB; 引物稀释: 8LoutB: nmoles 25.3 0.253ml H2O 100μM 10μl 90μl H2O 10μM 20μl 分装 8RoutB: nmoles 18.6 0.186ml H2O 100μM 10μl 90μl H2O 10μM 20μl 分装 Prime STAR PCR: buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA 1μl 8Lout 1μl 8Rout 1μl Prime STAR 1μl 功率谱H2O 32μ 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 45s 53℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min 电泳: | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-28 处理细胞培养用品: | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-11-29(四) 处理细胞培养用品:高压,烘干。 配PBS: PBS配制: 200ml NaCl 1.6g KCl 0.04g KH2PO4 0.04g Na2HPO4.12H2O 0.726g or Na2HPO4 0.58g 高压灭菌。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-12-3(一) 过夜贴壁 换液:hyclonen南美FBS 观察(复苏后12h): 感觉培养基变较快,但未见染菌现象; 部分细胞贴壁,但倒出液体后,发现一些细胞又被倒出,可能贴壁不牢固; 有待后续观察。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-12-4(二) | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-12-5(三) 换液:hyclonen南美FBS 观察(复苏后60h): 培养基颜未见更显著变化; 贴壁细胞已分裂,形成落,约<10个细胞,细胞形态未全部展开。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-12-6(四) 100mg/ml G418配制: 1g G418加10ml PBS(直接溶在原瓶中),过滤分装1.5ml EP管,-20℃保存。 细胞观察: 消化换瓶:冷胰酶消化70秒,1 ml 移液器吹扫100下。 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-12-8(六) 细胞换液:1700-1800 一多半细胞形态正常 一些圆形未展开的细胞上有小突触 还有散在的S行管状 那个S型的东西我前些天看看到过 但只到一个 还以为是什么杂质 但今天明显增多了 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
2012-12-9(日) 细胞观察: 培养基变较快,漂浮单细胞增多,为展开贴壁细胞比以前同期多,展开细胞形态正常贴补层状态良好,未见大面积脱落及成团漂浮初步排除大面积染菌的可能。乐观的解释是,在最近的24小时中,细胞进入对数增长期,培养基养分过快消耗,造成一些细胞脱落和培养基变。如果传代后恢复正常状态,就能支持这种解释。下一步计划,传代1:4、铺板、保存原瓶细胞次日用于提取DNA。 消化细胞:1:4传代 铺板:
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2012-12-10(一) DNA提取: FUT8 PCR: Prime STAR PCR: buffer 10μl dNTP Mix 4μl CHO-S DNA 1μl 8LoutA/B 1μl 8RoutA/B 1μl Prime STAR 1μl H2O 32μ 1:95℃ 5min 2-30:94℃ 45s 53℃ 30s 72℃ 30s 31:72℃ 5min 电泳:无任何条带。 | 2012-12-10(一) 换液: 铺23孔的24孔板换液; 12/9日1:4传代换液; 12/9日传代剩下的细胞消化,用于DNA提取。 细胞观察0800: 细胞液还是变较快,昨晚铺板的细胞已经贴壁,但尚未展开分裂。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||
G418杀伤曲线: 消化: 计数: 稀释:1000cell/ml; 24孔板每孔100μl,约100cell; 补完全培养基200μl; 12-24h培养贴壁展开形态良好; | |||||||||||||||||||||||||||||||||
G418 100mg/ml配制: 10ml G418 1g PBS 10ml 0.22μm过滤。 抗生素培养基配制: 10个1.5ml EP管(高压灭菌); 加入1ml 完全培养基; 分别吸出3、4、5,、6、7、8、9μl; 补入3、4、5,、6、7、8第三产业发展、9μl G418(100mg/ml); 形成G418终浓度0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mg/ml。 PBS 300μl洗涤24孔板; 加入相应浓度G418完全培养基300μl;
观察换液(含G418); 10-14天; | |||||||||||||||||||||||||||||||||
乙草胺 | |||||||||||||||||||||||||||||||||
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