HEK293F 细胞瞬时表达 PDGFR-β／Fc蛋白的条件优化 洪坡;袁凤媚;黄嘉慧;刘东晨;张途;谢秋玲
【摘 要】To optimize the conditions for transient transfection in HEK293F cells and improve the pro-duction of PDGFR-β,DNA (pXLG-PDGFR-β) and PEI were separately diluted in ultra-pure water, mixed together,and incubated at room temperature.The PEI-DNA complex was then added to the cells, and the culture was incubated at 37 ℃with 6% CO2 with agitation at 180 r/min,then incubated for 7 days.The PDGFR-β/Fc concentration in the culture medium was determined by sandwich ELISA.The conditions including cell density,DNA concentration and ratio of DNA to PEI,as well as other effectors such as adding of VPA and peptone were optimized.The results showed that transient gene expression yields of PDGFR-β/Fc can be maximized under following conditions:4 ×106 cells/mL,2.0 μg/106 cells DNA,1∶2 ratio of DNA and PEI and polymerize 5 minutes.The productivity can be further increased with adding of 3 mmol /L VPA,glucose and 1 g/L TN1.The experiment showed that when the conditions for transient transfection of HEK293
电力安全性评价
F cells were optimized,the PDGFR-β/Fc yields up to 55 mg/L were achieved at the conditions,which laid a foundation of PDGFR-β/Fc expression for larger scales transfec-tion in HEK293F cells.%为优化 HEK293F 细胞瞬时转染条件，提高 PDGFR-β的蛋白表达量，采用聚乙烯亚胺（Polyetherimide， PEI）为转染试剂，将质粒 pXLG-PDGFR-β／Fc 与 PEI 混匀聚合后加入到细胞悬液，37℃，φ＝6％ CO2，180 r／min 悬浮振荡培养，培养7 d 后收集样品，ELISA 检测 PDGFR-β蛋白的浓度。对细胞密度、DNA 浓度和 m （DNA）：m （PEI）、聚合时间以及添加物（丙戊酸钠、葡萄糖和蛋白胨）进行优化。结果显示，HEK293F 细胞瞬时转染的最佳条件为：细胞密度4×106 cells／mL、DNA 浓度2.0μg／106 cells、m （DNA）：m （PEI）为1：2、聚合时间5 min。同时，48 h 内添加3 mmol／L 丙戊酸钠，第3天补加葡萄糖和1 g／L 的蛋白胨 TN1可使 PDGFR-β／Fc 的蛋白表达量明显提高。实验表明，经过对 HEK293F 细胞瞬时表达 PDGFR-β的转染条件的优化，蛋白表达量可达55 mg／L，为更大规模瞬时转染生产 PDGFR-β／Fc 蛋白奠定了基础。【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》经验与勇气
【年(卷),期】2015(000)005
【总页数】6页(P96-101)
【关键词】PDGFR-β/Fc;HEK293F 细胞;瞬时表达
【作 者】洪坡;袁凤媚;黄嘉慧;刘东晨;张途;谢秋玲
希波战争【作者单位】暨南大学生命科学技术学院∥广东省生物工程药物重点实验室∥基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632;暨南大学生命科学技术学院∥广东省生物工程药物重点实验室∥基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632;暨南大学生命科学技术学院∥广东省生物工程药物重点实验室∥基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632;暨南大学生命科学技术学院∥广东省生物工程药物重点实验室∥基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632;暨南大学生命科学技术学院∥广东省生物工程药物重点实验室∥基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632;暨南大学生命科学技术学院∥广东省生物工程药物重点实验室∥基因工程药物国家工程研究中心，广东 广州 510632
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78中国劳动部
过去10年中，瞬时基因表达系统快速生产复杂性蛋白技术得到了广泛应用［1］，瞬时基因表达 (Transient gene expression，TGE)是一种使用动物细胞悬浮培养技术快速生产毫克级至克级重组蛋白的方法，目前最常用的细胞株是CHO细胞和HEK 293细胞，这两种细胞可适应无血清悬浮培养［2］。HEK293细胞凭借其易转染、高表达、天然人糖基化修饰、允许蛋白正确折叠和相关翻译后修饰等优点使用最为广泛［3－4］。聚乙烯亚胺(PEI)是一种在小规模到大规模蛋白表达中广泛使用的转染试剂，它具有高效性和经济性等优点［2，4－5］。PEI是一种阳离子聚合物，可与 DNA 结合凝聚成带正电荷的纳米颗粒，颗粒与细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖黏合，并通过胞吞作用进入细胞，从而促进细胞对DNA的摄取［6－7］。线型和支化的25000 PEI是使用最为广泛的聚合物，其中线型PEI转染效率更高、毒性更小，常被用于悬浮培养的 HEK293 细胞的转染［8－10］。
血小板源性生长因子 (platelet derived growth factor，PDGF)具有诱导肿瘤中淋巴管生成和促进肿瘤淋巴转移的功能，是潜在的肿瘤分子靶标［11］。可溶性血小板源性生长因子受体 (sPDGFR)可与细胞膜表面的PDGFR竞争性结合 PDGF，从而阻断PDGF的生物学效应，有望用于肿瘤的［12－13］。PDGFR主要包含两种结构相似的受体亚型PDGFR-α 和 PDGFR-β。PDGFR的 β 链膜外区与人IgG Fc片段的重组型可溶性融合蛋白s
PDGFR-β/Fc受体作为一种新型的PDGF拮抗剂，具有很好的应用前景。
本实验用 PEI介导 PDGFR-β/Fc质粒转染HEK293F细胞，影响转染效率和蛋白表达的因素有活细胞接种密度、DNA浓度、PEI浓度、DNA与PEI聚合时间以及添加物［14］，本实验对上述因素进行优化。
1 材料和方法
1.1 质粒和细胞株
HEK293F细胞由南开大学惠赠，pXLG-PDGFR-β/Fc为本实验室保存。
1.2 主要试剂及仪器
无内毒素质粒抽提试剂盒 (NucleoBond Xtro Maxi Plus)购自德国 MN公司;PEI购自 Polysciences公司;EX-CELL®293无血清培养基购自美国SIGMA公司;RPMI1640培养基购自美国Invitrogen公司;Goat anti-Human IgG(Fc)、Goat pAb to Hu IgG(AP)购自Abcam公司;蛋白胨购自Organotechnie公司;TubeSpin一次性生物反应器购自TPP公司;ACCU-CHEK®血糖仪购自Roche公司;酶标仪购自Thermo公司。
1.3 细胞培养
HEK293F细胞接种于含10 mL EX-CELL®293无血清培养基 (含6 mmol/L谷氨酰胺)的50 mL TubeSpin管中，置于37℃，φ=6%CO2，180 r/min恒温震荡培养箱中培养，培养密度控制在0.5×106cells/mL至4×106cells/mL范围内。在转染前1 d，将细胞离心 (1000 r/min，5 min)，新鲜培养基重悬至2×106cells/mL。
1.4 质粒制备
用无内毒素质粒抽提试剂盒抽提质粒，经琼脂糖凝胶电泳验证。NanoDrop2000测定质粒DNA浓度和纯度，A260/280在1.8～1.9，A260/230应大于2.0。
麦克斯韦关系式1.5 转染
转染前用血球计数板对细胞计数，细胞活率需在95%以上。将实验所需细胞量的细胞悬液离心(1000 r/min，5 min)，一定量RPMI1640培养基于50 mL TubeSpin管中重悬。同时，按实验组设置，将一定量的质粒DNA和PEI溶液混匀聚合。将DNA与PEI聚合溶液加入细胞悬液混匀，置于恒温震荡培养箱中培养。每隔24 h收样检测目的蛋白质量浓度。
1.6 葡萄糖质量浓度测定
采用ACCU-CHEK®血糖仪测定。
1.7 PDGFR-β/Fc蛋白质量浓度测定
采用ELISA方法测定。以羊抗人IgG-Fc包被96孔酶标板，4℃过夜。按一定梯度稀释IgG标准品和培养液上清样品，加入孔中37℃孵育1 h，扣干、洗板后加入w=0.5%BSA稀释的碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG，37℃孵育1 h。加显液孵育15 min，405 nm波长下酶标仪检测A值。通过标准曲线计算PDGFR-β蛋白质量浓度。每孔做3个重复。
2 结果与分析
2.1 HEK293F细胞瞬时转染基本条件的优化
PEI介导的瞬时转染方法中，影响瞬时转染条件的基本因素有细胞接种活细胞密度、质粒DNA浓度、PEI浓度、DNA与PEI的聚合时间。本实验中，细胞接种密度设定2×106cells/mL和4×106 cells/mL两个水平，DNA浓度设定1.5 μg/106cells和 2.0 μg/106cel
ls两个水平，DNA∶PEI设定为1∶2、1∶3、1∶4 三个水平，聚合时间设定为 5、10、15 min 3个水平。本实验根据表一进行单因素实验对上述条件进行优化，每组实验重复3次。
表1 HEK293F细胞瞬时转染基本条件的优化Table 1 The primary condition optimization of PDGFR-β/Fc expression for transient gene expression in HEK293F cellsVCD/(106·mL－1)DNA/(10 －6μg·cells－1)m(DNA):m(PEI)聚合时间/min ρ(蛋白)/(mg·L－1) 10 6.4 ±1.041.5 1∶4 10 4.4 ±0.1 4 1.5 1∶4 10 4.8 ±0.051.5 1∶2 15 4.0 ±0.5 4 1.5 1∶2 15 3.8 ±0.531.5 1∶3 15 3.6 ±0.19 4 1.5 1∶3 15 2.1 ±0.31.5 1∶4 15 1.7 ±0.4 4 1.5 1∶4 15 2.5 ±0.32.0 1∶2 5 10.9 ±0.23 4 2.0 1∶2 5 15.6 ±0.642.0 1∶3 5 8.2 ±0.24 4 2.0 1∶3 5 11.4 ±0.332.0 1∶4 5 7.5 ±0.17 4 2.0 1∶4 5 7.4 ±0.62.0 1∶2 10 9.80 ±0.13 4 2.0 1∶2 10 11.7 ±0.32.0 1∶3 10 6.1 ±0.28 4 2.0 1∶3 10 7.5 ±0.212.0 1∶4 10 4.8 ±0.1 4 2.0 1∶4 10 4.8 ±0.12.0 1∶2 15 3.1 ±0.5 4 2.0 1∶2 15 2.1 ±0.252.0 1∶3 15 1.9 ±0.59 4 2.0 1∶3 15 2.4 ±0.3222.0 1∶4 15 1.4 ±0.4 4 2.0 1∶4 15 2.0 ±0.4
结果显示 (表1)，当细胞接种密度为2×106 cells/mL时，DNA浓度增加，蛋白表达量略有增加，这是因为受到细胞密度的限制，细胞对质粒DNA的摄入已达到峰值。当细胞接种密度
为4×106cells/mL时，增大DNA浓度，蛋白表达量明显增加。增大PEI与DNA的比例，蛋白表达量相对稍低，细胞计数结果显示，增大PEI的浓度，细胞毒性增加，细胞活率相对低。增加DNA与PEI聚合时间，蛋白表达量降低。经过组合优化，HEK293F细胞瞬时表达PDGFR-β融合蛋白最佳条件是细胞接种密度4×106cells/mL、DNA浓度2.0 μg/106cells、DNA/PEI比例1∶2、聚合时间 5 min，蛋白表达量可达15.6 mg/L。
2.2 HEK293细胞瞬时转染其它条件的优化
2.2.1 添加VPA浓度及添加时间的优化 在前述优化的基本条件下，本实验先对VPA添加浓度进行优化，VPA添加浓度为2、3、4、5 mmol/L，细胞转染后24 h添加。然后对VPA的添加时间进行优化，VPA添加时间为转染后0、24、48 h，探索添加时间的影响。每组实验重复3次。
图1 添加不同浓度VPA对PDGFR-β表达的影响Fig.1 Optimization of VPA concentration
克林顿
图2 不同时间添加VPA对PDGFR-β表达的影响Fig.2 Optimization of time for adding VPA
不同浓度的VPA对细胞表达PDGFR-β蛋白均有促进作用 (图1)，在3～4 mmol/L的VPA的效
果最好。在添加3 mmol/L VPA时，PDGFR-β蛋白表达量最高 (30 mg/L)，约为对照组的2倍。细胞瞬时转染后，在48 h内的不同时间添加VPA，蛋白表达量相近 (约28 mg/L)，表明转染后48 h内的不同时间添加VPA对蛋白表达影响不大 (图2)。
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