cya/crp缺失株 cya和crp是研究非常深入的沙门氏菌毒力调节基因。cya编码环化腺苷酸合成酶，crp编码cAMP受体蛋白，cya和crp基因的突变株影响参与碳水化合物和氨基酸代谢的基因表达，和影响菌毛与鞭毛的表达。crpcya突变株能在普通培养基上生长，但由于crp缺失，消除了细菌在哺乳动物中摄取cAMP的唯一途径，因此在宿主体内不能转化成野生型菌株?。cya和crp在染体上相隔11分钟，所以2个基因恢复成野生型的可能性也很小。该类沙门氏菌具有下列特征：（1）丧失代谢碳水化合物、氨基酸和小肽的能力，因而生长比较缓慢。（2）不能合成I型菌毛，但表达鞭毛抗原，从而具有运动性。（3）生化特性不同于野生型鼠伤寒沙门氏菌，不能利用柠檬酸盐和甘油，对多数糖类不发酵，不产生疏化氢，但通过一般的血清学方法，可以确定为鼠伤寒沙门氏菌。尽管在哺乳动物细胞中存在cAMP，但在沙门氏菌入侵的胃肠组织、液体和其它细胞中的浓度远低于cya缺失株展现野生型表型所需量。而且crp的缺失消除了cya缺失株从体内摄取cAMP的可能。 asd基因 asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶（aspartate beta- semialdehyde dehydrogenase），该酶是二氨基庚二酸（文献综述范文diaminopimelic acid，DAP）生物合成途径中的必需酶，asd缺失株在无外源DAP条件下溶菌死亡，表达载体中含有asd组胺基因，与宿主asd情报学报 投稿-缺失表型互补，转化子在无外源DAP条件下生长，发展成一种无抗性的宿主载体平衡致死系统
（Asd-Balanced Lethal Vector System）（Curtiss，1989）。
asd质粒载体平衡致死系统 应用最多的系统是失活沙门氏菌的asd基因。asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶（aspartate L-semialdehyde dehydrogenase），是二氨基庚二酸（diaminopimelic acid，DAP）生物合成途径中的必需酶，DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个组分，asd-缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，最终溶菌死亡。由于哺乳动物组织中不含DAP，因此突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内均被降解。将目的基因插入含asd的质粒，转化asd-宿主菌后可形成互补，asd质粒丢失的asd-沙门氏菌在体内死亡，只有含有asd质粒的沙门氏菌才能存活。并稳定的在体内体外表达外源抗原。此外，由于用asd代替了抗生素抗性标记，因而更加安全（Nakayama，1988；Galan，1990）。 图4-35：质粒pYA3493的酶切鉴定
Fig.4-35: Identification of plasmid pYA3493
M1: DNA Ladder (DL15000)
1: pYA3493/BamHI+XbaI 2: pYA3493/BglⅡ+XbaI
3: pYA3493/BamHI 4: pYA3493/HindⅢ
5: pYA3493/BglⅡ 6: pYA3493/EcoRI
7: pYA3493/XbaI 8: pYA3493/SalI
9: pYA3493/ EcoRI+XbaI
M2: DNA Ladder (DL2000)
3.2.8 沙门氏菌电转化(自徐引第p54/56)
3.2.8.1 沙门氏菌电转化感受态细胞的制备
(1) 将沙门氏菌在LB琼脂平板划线于37℃培养箱培养，第二天挑取单菌落于3 ml LB液体培养基37℃，200 r/min摇床过夜培养。
(2) 将过夜培养液按1:100接种50 ml LB液体培养基，37℃ 200 r/min培养使细菌分光光度值OD600达0.3－0.4，一般需2.5－nand闪存3 h。
(3) 4℃ 6000 r/min离心15 min，弃上清液后收集菌体，用预冷的50 ml去离子水轻轻悬浮菌体。
(4) 重复（3）步骤2次，去离子水体积分别为25、12.5 ml。
(5) 4℃ 6000 r/min离心15 min，弃上清液后收集菌体，用预冷的50 ml 10%甘油轻轻悬浮菌体。
(6) 重复（5）步骤3次，10%甘油体积分别为50、25、12.5 ml，最后于4℃ 7500 r/min离心15min收获细胞。
(7) 沉淀细胞中加入0.25 ml冰预冷的10%甘油重悬，悬浮的感受态细胞等量分装（40 μl），立刻用于电转化或-80℃保存备用。
3.2.8.2 沙门氏菌的电转化
(1) 把2µl大提的质粒并经PEG8000纯化，且不含盐离子的质粒加入到新鲜的40 µl感受态细胞中，混合后放冰上预冷30 min。
(2) 设置电转仪（BioRad GenePulser Ⅱ）参数:电压2.0Kv，时间4ms，电容25µF和脉冲电阻200Ώ。
(3) 把冷却的混合物加入0.2cm电转杯中，把杯外面的水擦干净后电击。
(4) 把电击产物迅速从电转化杯中取出到1.5ml EP管，立刻加入1 ml SOC培养基于37℃摇床复苏1 h。
(5) 复苏产物等份涂布于事先在37℃培养箱中预热的相应的LB固体平板。
Localization Analysis of attenuated（vt 削弱） Salmonella typhimurium(鼠伤寒沙门氏菌) with oral immunization
Hui Zhang1, Maozhi Hu1,2, Zhiqiang Gu1 , Xin′an Jiao1*, Shizhong Geng1,
Xiaoming Zhang1, Zhiming Pan1
(1Jiangsu Key Laboratory of Zoonosis, 2Testing Center of Yangzhou University, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China)
Abstract: To analyze the localization of attenuated Salmonella typhimurium after oral immunization. Prokaryotic
expression plasmid pYA33-DsRed, carrying the RFP gene, was constructed构建 and electro-transformed电转化 into an attenuated
strain(品)系, 菌株, 变种 X4550 of Salmonella typhimurium, the recombinant名词 bacteria
were named as X4550(33-DsRed).
The macrophage巨噬细胞 cell line RAW264.7 and bone marrow（骨髓） dendritic cell (BMDC骨髓源树突状细胞) were invaded by X4550(33-DsRed)
in vitro在试管中，在生物体外. Furthermore, BALB/c mice were immunized with recombinant bacteria orally. RFP positive cells (RFP+
cells) were detected by Flow Cytometry（ [saI`tCmEtrI]血细胞计数）(FCM流式细胞术) from spleen脾, liver, Mesenteric肠系膜的lymp node (MLN肠系膜淋巴结), Peyer’s patch
(PP), Inguinal腹股沟的 lymph node (ILN腹股沟淋巴结). The invasion rate increased when the multiplicity多样性 of infection(MOI) were improved
in this two kinds of cells respectively. After oral immunization with X4550(33-DsRed), RFP+ cells were
detected by FCM on 1d, 2d, 3d, 5d, 7d in spleen, liver, MLN, PP, ILN cells. The first day, RFP+ cells were detected
in MLN and PP, and in PP at a higher rate of 1.4% than that of MLN. 0.4% RFP+ cells were detected the next day
in ILN. On 3th day, the rates of RFP+ cells were increased in all of above tissues or organs and decreased on the
5th day. At the 7th day, RFP+ cells couldn’t be detected in all tissues or organs tested. It is suggested that the invasion
ability侵袭力 and the transfer through mucosal黏膜的 pathway and targeting to recognize immune tissue or organs are favor
of the research in mucosal vaccine and the vaccine efficiency效力.
摘要: 分析减毒鼠伤寒沙门菌口服感染后在小鼠体内定位的情况。将构建的红荧光蛋白(RFP)
原核质粒pYA33-DsRed, 以电穿孔法转化减毒鼠伤寒沙门菌X4550, 重组菌命名为
X4550(33-DsRed)。重组菌分别感染巨噬细胞RAW264.7 和骨髓源树突状细胞(BMDC), 并用流式
细胞术检测红荧光细胞荧光强度。此外, 以不同剂量重组菌口服免疫BALB/c 小鼠, 并于免疫后
1d、2d、3d、5d、7d 取小鼠脾、肝、肠系膜淋巴结(MLN)、派伊尔氏结(PP)、腹股沟淋巴结(ILN)
细胞, 检测各组织器官中的红荧光阳性细胞百分率。重组菌对RAW264.7 细胞和BMDC 均具有
良好的侵袭力。口服小鼠后, 第1d, 仅在MLN 及PP 中检测到RFP 毛绍烈阳性细胞, 其中授益行为PP 中阳性细
胞达到1.4%; 第2 d, 在ILN 中达到0.4%; 第3 d, 各个组织器官中RFP 阳性细胞均有上升趋势,
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