Vol.7 No.1Feb. 2021
生物化工
Biological Chemical Engineering
第 7 卷 第 1 期2021 年 2 月
李浪1,2，吴桐宇2，姚宇峰2，黄青丽2，严继舟2*
（1.南昌大学 资源环境与化工学院，江西南昌 330031；2.上海赛唐生物技术有限公司，上海 201308）
摘 要：目的：确定CHO-K1细胞能否够分泌外泌体，运用液相谱-质谱联用技术鉴定无血清培养条件下CHO-K1细胞培养上清中的蛋白质和外泌体中蛋白质的成分。方法：将CHO-K1细胞驯化至无血清培养基中，采用exoRNeasy 血清/血浆试剂盒提取培养基中的外泌体，透射电镜复染法鉴定其大小和形态，质谱法鉴定标志蛋白；提取培养上清和外泌体中的蛋白，运用nanoLC-ESI-MS-MS 技术进行鉴定，对鉴定到的蛋白质进行基因本体论（GO）注释分析。结果：从培养上清样本中鉴定到1 243种蛋白质，分子质量范围在7~559 kDa，等电点（PI）在3~11；透射电镜下可见外泌体的双层膜小囊泡结构；从外泌体 样本中鉴定到1 259种蛋白质，分子质量范围在5~4 007 kDa，等电点在3~12，其中鉴定到外泌体标志蛋白有膜连蛋白、肿瘤易感蛋白、Rab 蛋白、热休克蛋白-90和热休克蛋白-60；GO 注释结果显示上清蛋白和外泌体蛋白主要都来源于细胞器和细胞的膜结构。结论：形态学和标志蛋白的鉴定结果确认CHO-K1细胞的培养上清中存在外泌体，并初步构建了无血清条件下CHO-K1细胞的培养上清蛋白质和外泌体蛋白质的质谱数据集。
关键词：CHO-K1细胞系；上清蛋白；外泌体；蛋白质组；质谱中图分类号：Q26 文献标识码：A
Proteomic Analysis of CHO-K1 Cell Culture Supernatant and Exosomes
LI Lang 1,2, WU Tongyu 2, YAO Yufeng 2, HUANG Qingli 2, YAN Jizhou 2*
(1.School of Resources Environmental & Chemical Engineering, Nanchang University, Jiangxi Nanchang 330031;
2.Cellgene Bioscience, Shanghai 200120)Abstract: Objective: To confirm that CHO-K1 cells can secrete exosomes, using LC-MS to identify protein components of CHO-K1 cell culture supernatant under serum-free culture conditions and the protein components in the exosomes. Methods: Adopting the serum-free medium domestication cell, exosomes were isolated by exoRNeasy Serum/
Plasma Starter Kit from the culture medium. The particle size and morphology of exosomes were measured by transmission electron microscopy. The expressions of exosomal surface protein markers were determined by mass spectroscopy. Using nanoLC-ESI-MS-MS technology to identify proteins in culture supernatant and exosomes, perform gene ontology annotation analysis on the identified proteins. Results: 1 243 proteins were identified from the culture supernatant samples, the molecular masses range from 7~559 kDa, and the isoelectric point (PI) is between 3~11. The small vesicle structure of the double membrane of exosomes under the transmission electron microscope 1 259 proteins were identified from exosomal samples with molecular masses ranging from 5~4 007 kDa and isoelectric points between 3~12. And exosomal marker proteins were identified: annexin, tumor-susceptible protein, Rab protein, heat shock protein-90, heat shock protein-60. The annotation results of gene ontology show that cell culture supernatant proteins and exosomal proteins are mainly derived from organelles and membrane structures. Conclusion: The identification results of morphology and marker protein confirmed the presence of exosomes in the culture supernatant of CHO-K1 cells. And preliminarily constructed a mass spectrum data set of CHO-K1 cell culture supernatant protein and exosomal protein under serum-free conditions.
Key words : CHO-K1 cell line; supernatant protein; exosomes; proteome; Mass Spectrometry
作者简介：李浪（1977—），男，安徽东至人，硕士，研究方向：生物化工。
通信作者：严继舟（1963—），男，湖北鄂州人，博士，教授，研究方向：干细胞和再生生物学、海洋生物医学。E-mail：**************。
文章编号：2096-0387（2021）01-0063-07
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目前，性重组单克隆抗体（mAb）和Fc融合蛋白在生物制药市场上占据主导地位，其市场份额占所有生物制剂的35%[1]。mAB等复杂重组蛋白的生产需要能够进行翻译后修饰的宿主细胞表达系统，所以目前的性重组蛋白主要由哺乳动物细胞表达生产[2]。中国仓鼠卵巢细胞（CHO细胞）能够在化学成分明确的无血清培养基中稳定持续生长，具有良好悬浮培养适应力且能进行高密度、大量、分批补料培养，经过数十年的发展和技术优化，目前已经成为商业化生产性重组蛋白的首选工程细胞[3]。2006—2014年，欧盟和美国批准上市的112种生物药物中，有65种是由CHO细胞表达生产的[4-5]。而2015—2018年，欧盟和美国共批准上市了68种性单克隆抗体药物，其中57种是由CHO细胞表达生产的[6]。
CHO细胞能将表达的重组蛋白分泌到培养基中，并且超过15%的上清蛋白是目标产物[7]。工业化的C
HO细胞能够在无血清的培养基中悬浮生长，以排除血清中不确定的蛋白成分对重组蛋白的影响。但工业化生产重组蛋白的方式主要是分批补料培养，活细胞分泌或死亡细胞裂解释放的蛋白质会随着培养时间的增加而逐渐积累在培养基中，不可避免地会对重组蛋白的质量造成影响。
外泌体是由生物活细胞分泌的细胞外小囊泡，其中包裹着蛋白质、DNA和RNA，能够介导细胞间的通信[8-9]。有研究发现，外泌体也能包裹重组蛋白[10]。因此，外泌体中的蛋白质组成与重组蛋白的质量也息息相关，而且外泌体的内含物的成分与细胞种类和状态有关。
为了确定CHO-K1（仓鼠卵巢细胞亚株）细胞能够分泌外泌体，同时鉴定无血清培养条件下CHO-K1细胞培养上清及外泌体中蛋白质的组成成分及性质，本研究采用膜亲和结合分离技术从CHO-K1的培养上清中分离出外泌体，并用透射电镜复染法对其进行形态学鉴定，同时运用液相谱-质谱联用技术对CHO-K1细胞的培养上清以及提取到的外泌体进行蛋白质质谱分析，并对鉴定到的蛋白质进行基因本体论（GO）注释分析，为进一步研究CHO宿主细胞蛋白对重组蛋白的影响提供基础数据。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1细胞系来源
日本之家
CHO-K1细胞系，购于赛百慷（上海）生物技术股份有限公司，初始为贴壁生长细胞，经无血清驯化后转为悬浮生长细胞。无血清驯化后的细胞冻存于上海赛唐生物技术有限公司。
1.1.2仪器与试剂
FS-150N超声仪，上海生析；1129 BBC 8生物安全柜，山东博科生物；QP-160 CO2培养箱，济南鑫贝西生物；L530RL医用离心机，湖南湘仪；CKX53紧凑型细胞培养显微镜，OLYMPUS；T75培养瓶，CORNING；3 kDa超滤离心管，Millipore；8~14 kDa 透析袋，国药；Q Exactive质谱仪，Thermo Fisher；Easy-nLC 1000液相谱仪，Thermo Fisher；CHO 细胞无血清培养基CHO Grow® CD、培养基DMEM/ F-12和L-谷氨酰胺，上海源培生物；胰酶-EDTA消化液，Bio-channel；胎牛血清（Fetal bovinc serum），GIBCO；磷酸盐缓冲液（PBS），海利克思；聚乙二醇 6000（PEG 6000），国药；外泌体提取试剂盒（exoRNeasy Serum/Plasma Starter Kit），QIAGEN。
1.2方法
1.2.1 CHO-K1细胞无血清培养驯化
为了确保收集到的上清蛋白均来自CHO-K1细胞，需要先将细胞驯化至无血清、无蛋白质成分的化学成分限定培养基中。用胰酶-EDTA消化复苏后的贴壁细胞，以1∶2~5的比例分装到75% DMEM/F-12
（A）和25% CHO Grow® CD（B）的混合培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。观察细胞生长状态并及时传代，待细胞完全适应当前混合比例的培养基后，将细胞传至下一个混合比例的培养基中培养。重复上述操作，直到细胞完全适应无血清培养基。混合培养基的混合比例为75%A+25%B、50%A+50%B、25%A+75%B、5%A+95%B、100%B。待细胞完全适应无血清培养基后，每周按时传代两次。
1.2.2上清蛋白质的提取
当CHO-K1细胞完全适应无血清培养基后，待
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李浪等：CHO-K1细胞培养上清及其外泌体的蛋白质组分析
细胞活力达到95%以上，细胞生长密度达70%~80%时，取20瓶细胞，将细胞悬液转移至50 mL离心管中，5 000 r/min离心10 min，回收上清。将上清转移到透析袋中，用PEG 6000于4 ℃包埋处理，并及时更换PEG 6000，当透析袋中的液体浓缩到合适体积后，将溶液转移至3 kDa的超滤离心管中进行超滤浓缩，并用1×PBS进行缓冲液置换，最终将溶液浓缩至 1 mL。因为蛋白质表达具有时空性，因此再取培养72 h后的细胞20瓶，按上述方法操作回收上清蛋白进行第二次质谱检测。
1.2.3外泌体的分离纯化
实验采用QIAGEN公司的exoRNeasy Serum/ Plasma Starter Kit试剂盒收集CHO-K1培养上清中的外泌体。按“1.2.2”的方法浓缩细胞培养上清，用 0.8 μm的过滤器过滤，将上清样品和外泌体试剂盒中的XBP缓冲液在离心管中按1∶1比例混合，轻轻将离心管上下颠倒5次，混合均匀后加到exoEasy 自旋柱上，500 g离心10 min。丢弃滤过液并将离心柱放回原来的收集管中。向离心柱中加入10 mL外泌体试剂盒中的XWP缓冲液，5 000 g离心5 min，弃去过滤液和收集管。将离心柱转移至新的收集管中，向柱中加入400 μL外泌体试剂盒中的XE缓冲液，孵育1 min，500 g离心5 min，收集洗脱液。将洗脱液重新上样至离心柱上，孵育1 min，500 g离心 5 min，收集洗脱液并转移至无菌离心管中，洗脱液中即为外泌体。
1.2.4外泌体的鉴定
一周立波秀2011对收集到的外泌体采用透射电镜负染法进行形态学鉴定。质谱鉴定外泌体蛋白成分，确定是否有外泌体的标志蛋白。
1.2.5外泌体蛋白质的提取
收集得到的外泌体，用超声仪破碎：80 W超声2 s，停10 s，循环60次。12 000 g离心10 min。再取传代72 h后的细胞20瓶按上述方法提取外泌体蛋白质重复进行第二次蛋白质检测。
1.2.6nano LC-ESI-MS-MS质谱检测
样本经酶解后用Easy nLC液相系统进行分离，缓清债
冲液：A液为0.1%甲酸水溶液，B液为0.1%甲酸乙腈水溶液（乙腈为84%）。谱柱为5 μm C18柱 （2 cm×100 μm），分析柱为3 μm C18柱（75 μm× 100 mm），流速300 nL/min，梯度洗脱。经谱分离后的肽段用Q-Exactive质谱仪进行质谱分析。质谱分析时间为60 min，正离子模式运行，扫描范围为300~1 800 m/z，质谱数据采集方法为每次全扫描（full scan）后采集20个碎片图谱（MS2 scan）。二级质谱中动态排除设置为60.0 s。
1.2.7数据分析
得到原始数据采用Mascot 2.2软件进行数据库检索，蛋白质数据库为中国仓鼠数据库（Uniprot-CHO）。搜库参数如下：enzyme为Trypsin；missed；cleavage sites设为2；固定修饰为Carbamidomethyl (C)；动态修饰设定Oxidation (M)。数据库检索鉴定到的蛋白质必须通过设定的过滤参数FDR≤0.01，score≥20。在得到搜库结果后，满足unique peptide≥1的为可信蛋白。对鉴定到的可信蛋白，通过Uniprot数据库进行基因本体论（GO）注释分析。
2结果与分析
2.1培养上清蛋白质质谱鉴定结果
两次上清蛋白质的质谱检测总离子流谱图见图1。第一次质谱鉴定得到2 697个蛋白质，形成 1 281个蛋白质组；第二次质谱鉴定得到2 497个蛋白质，形成1 202个蛋白质组。经过进一步筛选，最终从两次培养上清样本中鉴定出蛋白质1 243个。分子量和等电点的分布趋势见图2：培养上清蛋白质的分子量范围在7.4（40S 核糖体蛋白S28，Q99PF7）~559.5（AHNAK蛋白，A0A3L7HVN8）kDa，主要分布在200 kDa以内。等电点分布在3.9（酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A，A0A3L7HQ41）~11.1（组蛋白H2A 1型，G3HDT6），集中分布在4~10。
GO注释结果如图3所示，从细胞成分（CC）上看（图3A），鉴定到的上清蛋白主要来源于细胞器和细胞的膜结构，分别占23%和12%。其中标志性的细胞器蛋白如内质网标志蛋白钙网蛋白（Calreticulin，
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生物化工2021年
Q8K3H7）和蛋白质二硫键异构酶（Protein disulfide-isomerase，A0A061I0G5），线粒体标志蛋白细胞素C（Cytochrome c，G3H2K2）和己糖激酶-1（Hexokinase-1，G3H6T5），溶酶体标志蛋白溶酶体相关膜糖蛋白1和2（Lysosome-associated membrane glycoprotein-1/2，G3HK56/P49130），细胞膜标志蛋白如埃兹蛋白（Ezrin，A0A061IM94）等。除各种细胞内的蛋白外，还有8%的蛋白质属于细胞外区域，这些蛋白由细胞内合成后转运到细胞外，属分泌蛋白。
从生物过程（BP）层面来看（图3B），上清蛋白ua
主要参与细胞过程（如细胞死亡、生长、识别聚集等过程）和代谢过程，分别占33%和21%。从分子功能来看（图3C），上清蛋白主要是执行分子非共价结合功能和催化功能，分别占50%和33%。催化功能则是指具有催化活性的蛋白酶，通过进一步的GO 注释发现，具有水解酶活性的蛋白质最多（图
3D）。有研
（A）第一次质谱检测；（B）第二次质谱检测
图1
细胞培养上清蛋白质的质谱检测总离子流图
图2
雪崩危情
上清蛋白质分子量及等电点分布
（A）细胞成分注释结果；（B）生物过程注释结果；（C）分子功
能注释结果；（D）分子功能进一步注释结果
图3 上清蛋白质基因本体论注释结果
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李浪等：CHO-K1细胞培养上清及其外泌体的蛋白质组分析
究显示，这些水解酶是导致重组蛋白质量和活性下降的原因之一，如组织蛋白酶D（A0A3L7HWC9）被证明是重组单克隆抗体产生颗粒的原因[11]，基质金属蛋白酶-19（A0A3L7IHE9）会切割重组蛋白[12-13]，羧肽酶（G3H1D5）则与重组组织型纤溶酶原激活剂（t-PA）、重组人红细胞生成素以及重组免疫球蛋白G（IgG）羧基端的赖氨酸和精氨酸异变有关[14]。2.2 外泌体鉴定
形态学鉴定结果见图4，电镜下可见清晰的外泌体囊泡结构，直径在100 nm 左右，属于外泌体的粒径范围
（30~200 nm）。
图4 外泌体形态学鉴定结果
质谱鉴定结果显示，样本中存在外泌体标志蛋白：膜连蛋白（Annexin，A0A3L7HVV8）、四次跨膜蛋白（Tetraspanin，G3HRL6）、肿瘤易感蛋白（TSG，A0A061I931）、Rab 蛋白（Rab10/Rab11A，
A0A3L7HB32/A0A3L7HV57）、热休克蛋白90（HSP 90，G3HC84）和热休克蛋白60（HSP 60，P18687）。结合形态学鉴定及标志蛋白鉴定结果，确认CHO-K1细胞能够分泌外泌体。2.3 外泌体蛋白质质谱鉴定结果
第一次外泌体样本的质谱检测总离子流谱图见图5A，从中共鉴定出2 202个蛋白质，形成963个蛋白质组；第二次细胞外泌体样本的质谱检测总离子流谱图见图5B，从中鉴定出3 047个蛋白质，形成1 550个蛋白质组。经过进一步的筛选，最终从两次鉴定中确定了1 259个可信蛋白质。外泌体蛋白质分子量和等电点的分布趋势见图6，其分子量最小为 5.6 kDa（40S 核糖体蛋白S27，G3H513），最大为 4 007 kDa （肌连蛋白，G3HAC6，因分子量过大未在图5中展示），多数蛋白质的分子量集中分布在200 kDa
宝应县机关幼儿园以内。等电点则分布在3~12，4~10
的蛋白质最多。
A：第一次质谱检测；B：第二次质谱检测
图5
外泌体蛋白质的质谱检测总离子流图
图6 外泌体蛋白质分子量及等电点分布
对外泌体蛋白的GO 注释结果见图7，外泌体是脱离自细胞的双层膜结构小囊泡，因此外泌体中的蛋白质主要来源于细胞器和细胞中的膜结构，分别占24%和13%（图7A）。从生物功能方面来看（图7B），外泌体中的蛋白质多数参与细胞生理过程和代谢过程，分别占34%和19%。从分子功能来看（图7C），执行分子结合功能和催化活性的蛋白质最多，分别占50%和31%；执行催化活性的蛋白质中，同样以水解酶的占比最多（图7）。
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