国家新型城镇化规划2014-2020摘要：在几种CHO细胞单克隆抗体放大生产过程中，抗体链间二硫键被还原的现象很显著。这种还原性降解与收获阶段细胞受到显著的剪切力有关。这些抗体还原降解的案例导致了产品规格的失败和药物批次的后续损失。最近开发了一些新的方法来防止抗体的还原降解，包括改变细胞培养培养基，在收获前和收获后向细胞培养液(CCF)中加入添加剂，降低pH值，以及CCF(HCCF)收获后的空气鼓泡。本文进一步探讨了HCCF通气预防抗体还原降解的方法。在这里，建立了一个小规模的模型，使用一个3L生物反应器来模拟一个生产规模的收获容器的条件，并随后被用于评估几种空气鼓泡策略。此外，这些研究有助于进一步了解细胞裂解水平、氧消耗和抗体还原之间的关系。最后，对几种CHO细胞进行了通气效果和对产品质量的潜在影响的评价，表明空气鼓泡是一种有效的预防抗体还原的方法。
01
奥尼尔前言
马蒂斯剪纸重组单克隆抗体(RMAb)是目前生物工业中CHO细胞中常见的单克隆抗体。在rMAb的大
规模生产中，细胞一般在不锈钢生物反应器中培养。该产品在批量配方步骤之前进一步下游纯化。在离心过程中，细胞会受到机械剪切，从而导致细胞破碎。在Genentech的CHO rMAb生产过程中，由于离心过程中细胞剪切力过大，观察到了抗体链间二硫键的还原。这些还原反应是由细胞内的组分(如TRX/TrxR)或类似硫氧还蛋白的酶及其相关的酶途径中间体(如葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、己糖激酶)和一种能源(如NADPH)引起的，这些酶是在细胞破碎时释放的。研究表明，二硫键的还原与活的、活跃生长的细胞的机械细胞溶解水平有关，从而导致活性硫氧还蛋白系统组分的释放。相反，细胞死亡时释放的还原酶在收获时可能不活跃，能量可能被耗尽。我们制定了多种策略来防止这种抗体还原事件，包括在ccf和hccf中添加化学抑制剂，以及通过空气鼓泡保持hcf中最低的溶解氧(dO2)水平，以提高抗体的氧化环境。
哺乳动物细胞依靠几种系统来维持每个细胞内在适当状态下的氧化还原电位。目前研究的一些含巯基氧化还原酶系统包括硫氧还蛋白/硫氧还蛋白还原酶(TRX/TrxR)和谷胱甘肽/谷胱甘肽二硫(GSH/GSSG)。这些系统调节细胞活动，如细胞信号、二硫键的形成和基因转录，也可以保护细胞免受活性氧(Ros)的侵害。氧在这些氧化还原酶系统中起着电子受体的作用，而补充氧在蛋白质复性中曾被用于促进二硫键的正确形成。考虑到这一点，并结合
Trexler-Schmidt等人描述的研究所获知识，对生产规模收获产生的HCCF的dO2趋势进行了评估。令人惊讶的是，dO2水平在几个小时内下降到了0%。这似乎与机械细胞裂解有关，并在随后的二硫键还原反应中起着重要作用。因此，在HCCF容器内实施空气鼓泡以促进氧化环境应有助于防止二硫键的还原。
民主革命溶解氧控制策略在细胞培养生物反应器中得到了广泛的应用。一种通用的鼓泡策略使用dO2探头，该探头向PID控制回路提供反馈，以缩放空气和/或氧气的鼓泡输出，使之达到适合维持所需dO2设定点的速率。在生物反应器的设计中考虑了许多因素，以提供足够的气体传输以保持较高的细胞密度，同时尽量减少由于搅拌或气泡破裂而可能损害细胞或蛋白质的潜在有害的剪切效应。
萧红的女儿本文通过开发和利用一个小规模模型来评价工艺要求和特点，探讨了空气鼓泡作为一种降低抗体的策略的方法。首先，利用3L生物反应器建立了模拟HCCF储罐条件的小规模模型。然后利用这个小规模的模型来评估几种防止二硫键减少的效果和对产品质量的潜在影响的空气鼓泡策略。用该方法对几株CHO细胞系进行了检测，以确保其制造的稳定性，并确定其是否能普遍应用于预防抗体还原。这些研究也使人们进一步了解细胞裂解水平、氧消耗和抗体还原之间的关系。
02
研究发现
（1）一种小规模鼓泡模型的建立
最初的实验研究对小型喷雾模型保持条件。LysedHCCF（85%法）是在2工作容积在3-L生物反应器在两个条件：50转搅拌用50 sccmN2覆盖和100 rpm搅拌无氮气覆盖。用Agilent生物分析仪测定了这两种保存条件下rMAb的还原水平，并与对照微型罐进行了比较。如图1所示，在两天保持时间后，在小型储存控制中观察到rMAb减少。与此形成对照的是，在100 rpm搅拌和无N2覆盖条件下，rMAb均未发生还原，50 rpm搅拌和N2覆盖条件下均能加速还原，一天停留时间后则发生还原。此外，由于表面从顶部空间转移，两个鼓泡器保持条件之间的dO2水平有显著差异。氮气覆盖层的存在导致液体中O2的去除，并将dO2水平提高到0%。当0%dO2在整个维持期内维持时，当还原活性(即胞内组分)在两天的停留期后耗尽时，就会观察到抗体二硫键的重新形成。二硫键的重构可能是抗体在给定的环境中获得了最低能量的更稳定构象的结果。然而，其他尚未确定的机制也可能在这里发挥作用。在没有氮气覆盖的情况下，dO2水平随着时间的推移而增加，这是由于空气在顶部空
天堂的间的表面转移，这也是由于较高的搅拌速率。根据这些结果，我们选择50 rpm作为未来研究的搅拌速率，并在大多数喷雾实验中采用N2覆盖，除非另有规定，因为它代表了降低抗体的最坏的情况。作为一个例外，观察到的dO2趋势没有N2覆盖被用于无鼓泡的保持情况。由于表面积与体积比较小，预计在制造规模的储罐中，表面转移将不那么显著。
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