背景
尿酸氧化酶(Urate Oxidase, EC1.7.3.3)，又称尿酸酶（Uricase）是生物体内嘌呤降解代谢途径中的一种酶，大部分生物在嘌呤的代谢过程中产生尿酸，而尿酸酶能催化尿酸氧化为尿囊素。许多物种中均发现有尿酸酶存在，但在鸟类，爬行类动物以及高等哺乳动物(灵长类包括人类)等生物的进化过程中，尿酸酶基因发生突变，使得在这些生物体内，嘌呤不能被氧化为尿囊素，而是以尿酸为终产物。尿酸及其盐类在水中溶解度很低，血液中过多积累会导致痛风综合症。痛风（gout）是一组嘌呤代谢紊乱所致的疾病，其临床特点为高尿酸血症（hyperuricemia）及由此而引起的痛风性急性关节炎反复发作、痛风石沉积、痛风石性慢性关节炎和关节畸形，常累及肾脏引起慢性间质性肾炎和尿酸肾结石形成。 图学网The pathway of purine metabolism
目前临床上痛风的主要药物是别嘌呤醇，它占领了美国95％以上的痛风药物的市场。它是尿酸代谢过程中黄嘌呤氧化酶的抑制剂，与嘌呤代谢物竞争性抑制黄嘌呤氧化酶，使次黄嘌呤及黄嘌呤不能转化为尿酸，从而减少尿酸的生成。但该药的副作用也很明显，个别病人可有发热、过敏性皮疹、腹痛、腹泻、白细胞及血小板减少，甚而肝功能损害等副作用。
尿酸酶可以氧化尿酸为可溶性的尿囊素，在基因工程技术发展以前，从微生物中提取尿酸酶可用于临床诊断和，例如产朊假丝酵母。但微生物
产酶量较低，限制了其广泛应用。通过DNA重组技术高效表达酶基因是一条提高产酶量的途径。迄今为止，已有多个物种的尿酸酶基因被克隆。 但是，尿酸酶仍具有蛋白质类药物的共同缺点，如在胃肠道内极易被蛋白酶水解；血浆半衰期较短，需反复多次注射；并且由于大分子化合物具有免疫原性，易产生过敏反应，同时还会因局部产生抗体而减效等，这些缺点限制了尿酸酶的大范围的、持续的应用。 实验内容
尿酸氧化酶的纯化尿酸氧化酶的性质研究发酵菌液（1）尿酸酶的动力学参数的测定↓ （2）尿酸酶的
酸碱稳定性测定超声破碎（3）温度对尿酸酶稳定性的影响 ↓
盐析
↓
DEAE离子交换
↓
SDS-PAGE
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实验一尿酸氧化酶粗酶提取
沉没之鱼一．实验目的
学习可溶性表达蛋白质的初步分离纯化
二．实验原理
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细菌工程菌胞内表达主要分为两种形式，一种是在强启动子条件下的高效表达，由于蛋白的过度表达，使蛋白不能及时有效折叠而发生无规则卷曲，
以固体颗粒的形式堆积于胞间质中，这就是所说的包涵体。另外一种是间质内的可溶性表达，即可以发生正常折叠，具有生物活性。一般情况下，细菌只要被正常破壁就可以通过离心的形式将包涵体和可溶性表达的蛋白分离开。用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料。
盐析一般是指溶液中加入无机盐类而使某种物质溶解度降低而析出的过程。蛋白质在水溶液中的溶解度是由蛋白质周围亲水基团与水形成水化膜的程度，以及蛋白质分子带有电荷的情况决定的。当用中性盐加入蛋白质溶液，中性盐对水分子的亲和力大于蛋白质，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失。同时，中性盐加入蛋白质溶液后，由于离子强度发生改变，蛋白质表面电荷大量被中和，更加导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。
三．实验用品
能源开发1器材：超声破碎仪，离心机
2 试剂：超声缓冲液：0.1 mol/L，pH 8.5 Tris-Gly（6.057g Tris，8.0449gGly，定容至500ml，定容前调pH至8.5。）
四．实验方法
发酵菌液4000 rpm×25 min离心，收集湿菌体，每1 g菌体加入15 ml 超声缓冲液。超声机粉碎破壁，功率300 w，工作时间5 s，间隔时间5 s，共90个循环。
取悬于超声缓冲液的菌体，10000 g×10 min离心，上清加(NH4)2SO4至40%浓度，静置1 h，12000 g×15 min离心，沉淀用3 ml 0.1 mol/L的pH 8.4 Tris-Gly悬溶；上清加(NH4)2SO4至70%浓度，静置1h，12000 g×15 min 离心，沉淀保留。
五．实验结果
1.量得发酵菌液体积
2.量得发酵所得湿菌体重量
3.超声破碎离心后测上清OD280，体积及留样1ml
实验二尿酸氧化酶柱纯化
一．实验目的
学习根据蛋白质所带电荷，选择离子交换树脂进行蛋白质的分离纯化。二．实验原理
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的称之阴离子交换树脂；而带有负电荷的称之阳离子树脂。离子交换层析可以用于蛋白质的分离纯化。由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
取环术Sepharose是表示以琼脂糖为基质的胶，Sepharose Fast Flow分的ＤＥＡＥ，ＣＭ，Ｑ，ＳＰ就是在Sepharose分别偶联上二乙基氨乙基，羧甲基，三甲胺基，磺丙基，作为弱阴，弱阳，强阴，强阳四种离子交换填料。三．实验用品
1.器材：
填料：DEAE-Sepharose F.F.；核酸蛋白仪；紫外分光光度计；梯度混合仪；
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