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酪氨酸酶活性抑制实验方案

1．1 材料：

酪氨酸酶（或用马铃薯制备）、L-酪氨酸、熊果苷、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠

恒温仪、紫外分光光度计、离心机。

1.2 试剂配制

新知

1)磷酸钠缓冲液(1/15 mol／L，pH=6．8)

精确称取1.000 g磷酸二氢钠，1.186 g磷酸氢二钠，加入少量去离子水溶解后，定容至500 mL，4℃冰箱保存备用。

2)L-酪氨酸溶液(7.5 mmol/L)

精确称取L_酪氨酸0.272 g，先加入数滴浓盐酸，加去离子水约50 mL，微热完全溶解后，用氢氧化钠溶液调pH至7左右，加去离子水定容至200mL。

3)受试液

精确称取受试样品0.1g，分别溶于20 mL去离子水，得到5 mg/mL的待测液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125 mg/mL。

4)阳性对照(+CK)

精确称取0.1 g熊果苷粉末，溶于20mL的去离子水中，得到5 mg/mL的阳性对照母液，再对倍稀释到2.5 mg/mL、1.25 mg/mL、0.625 mg/mL、0.3125盗窃罪的构成要件 mg/mL。

5) 酪氨酸酶液的制备

以新鲜完好的马铃薯制取酪氨酸酶液。具体操作为：将马铃薯洗净，于4℃预冷4h左右。去皮，切成约1.0 cm3丁状，于-20℃冷冻过夜。称重，按1：1( W:V )的比例加入4℃ 预冷的磷酸钠缓冲液，用组织捣碎机制成匀浆，3层纱布过滤，滤液于4000 r/min离心10 min，上清液即为所得的酪氨酸酶粗酶液，4℃保存，2 h内用完。

1.3 检测方法

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总反应体系为5mL。具体设计见表l。

在此体系中，受试液，包括阳性对照熊果苷的终浓度(mg/mL)梯度为0.03l25、0.062 5、0.125，0.25、0.5。

实验时，向试管中依次加入磷酸盐缓冲液、不同浓度梯度的受试液(包括阳性对照)、酶液，于30℃水浴10 min。然后加入底物L-酪氨酸，立即开始计时。测定反应20 min时475 nm波长下的吸光值。测定时，以相应的阴性对照为参比，用下列公式计算受试液(包括阳性对照)对酪氨酸酶的抑制率，并依据浓度一酶抑制率曲线估计半数抑制浓度(IC50)的近似值。

抑制率=[(A-B)/A]×l00％

其中， “A”为标准对照的吸光值， “B”为受试液(或阳性对照)的吸光值。每个实验做3个平行。抑制率高表明其对酪氨酸酶活性的抑制强度高。

表1 5mL试验体系设计