第32卷第3期光散射学报Vol.32No.3 2020年9月THE JOURNAL OF LIGHT SCATTERING Sep.2020
文章编号:1004-5929(2020)01-0224-06
表面增强拉曼光谱对抗肿瘤药物5-氟尿囉噪的检测研究 周国良12，黄光耀12，李X1，王宏志，杨良保"
"1中国科学院合肥物质科学研究院医学物理与技术中心，安徽合肥230031!中国科学技术大学，安徽合肥230026
3中国科学院合肥肿瘤医院，安徽合肥230031)
摘要：本文利用表面增强拉曼光谱技术(SERS)实现了抗肿瘤药物5-氟尿疇睫(5-FU)的灵敏检测。通过种
子生长法制备不同粒径的银纳米颗粒(Ag NPs)利用结晶紫(CV)作为探针分子评估基底的增强能力。将优 化的Ag NPs作为SERS基底，结合便携式拉曼光谱仪器，对不同浓度的5-氟尿疇睫(5-FU)标准溶液进行检 测，考察其检测限&最终利用标准加入法测定人体血清中5-FU&通过有机相沉淀去除蛋白质，降低检测干
扰。结果表明，血清中5-FU检测限为3.125!g/mL&
关键词：抗肿瘤药物！-氟尿疇睫；表面增强拉曼光谱；银纳米颗粒
中图分类号:O657.37文献标志码:A doi：10.13883/j.issn1004-5929.202003005
Detection of5-Fluorouracil by Surface Enhanced Raman Spectroscopy
ZHOU Guoliang12#HUANG Guangyao12#LI Pan1#WANG Hongzhi1宀#Yang Liangbao
(1.Center of Medical Physics and Technology,Hefei Institutes of Physical Science#Chinese Academy of Sciences,Hefei230031,China
2.University of Science&Technology of China,Hefei230026,China
3.Cancer Hospital,Chinese Academy of Sciences,Hefei230031,China)
Abstract：In this paper,Surface Enhanced Raman Spectroscopy(SERS)was used to realize
the sensitive detection of5-fluorouracil(5-FU).Silver nanoparticles(AgNPs)with different EiameterswereprepareEbyseeEgrowth methoE.CrystalViolet(CV)wasuseEasaprobe
molecule to evaluate the enhancement ability of the SERS substrate.The optimized AgNPs
wereusedasSERSsubs?ra?esand?hes?andardsoluionsof5-FU wi?hdi f eren?concen?ra-ions were de?ec?ed by por?able Raman spec?roscopy.Fina l y,5-FU spiked in human serum wasde?erminedaf?er?hepre?rea?men?ofserum.Pro?einwasremovedbyorganicprecipiai-on?oreducede?ec?ionin?erferenceand?hede?ec?ionlimi?of5-FUinserum was3.125!g/ mL.
Key words%an ineoplas?ic drugs!5-FU!SERS!Ag NPs
1引言
肿瘤一直是威胁人类生命健康的重大疾病之一，全世界每年有1400多万新病例和800多万癌症患者死亡。随着医疗行业的不断发展，抗肿瘤药物方面的研究也有着巨大的进步。但是一般的抗肿瘤药物本身就带有毒性，不仅仅对肿瘤细胞产生效果也会对自身的其他良好细胞造成一定的伤害，因此出现很多不良症状&5-FU是一种临床应用于结肠癌、直肠癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌、绒
收稿日期：219-07-06；修改稿日期：2020-03-07
基金项目：国家科技重大专项"重大新药创制”项目(201ZX09J18112)，安徽省自然科学基金(1908085QB65)，安徽省重点研究与发技(1804d08020308#201904d07020009)&
作者简介：周国良(1996-)，男，安徽合肥，硕士研究生，主要从事表面增强拉曼光谱用于药物浓度检测的研究,E-mail：zguol@ mail.ustc.edu
通讯作者：王宏志，E-mail：wanghz@hfcas.ac；杨良保，E-mail：lbyang@i m.ac
第3期周国良：表面增强拉曼光谱对抗肿瘤药物5-氟尿嚏喘的检测研究225
毛膜上皮癌、恶性葡萄胎、头颈部鳞癌、皮肤癌、肝癌、膀胱癌等的药物（1）。它通过抑制DNA来控制肿瘤细胞的增殖，但是其剂量与中毒剂量2是相近的，因此建立一种快速有效的检测5- FU药物浓度的方法，确定5-FU安全有效的剂量，在临床用药方面具有重要意义&
目前，高效液相谱（HPLC）⑶，已被广泛应用于全血5-FU的测定&虽然HPLC在灵敏度、准确性以及精密度上有很大的优势，但是对5-FU样品的前处理过程复杂，回收率低，检测时间长，同时也不利样本的快速检测。其次应用较多的是液质联用技术（LC-MS/MS）⑷。虽然上述常用方法在检测5-FU中有很好
的应用，但是存在不同程度的操作复杂、费时费力、成本高和试剂保存时间短等诸多缺点，且操作人员需要较高的专业技术，有碍于该技术的推广。因此，立一种速有的5-FU，具有重要的意义&
表面增强拉曼光谱（Surface-enhanced Raman spectroscopy,SERS）［5］是指当分子吸附于某些粗
糙的金属（Ag、Au、Cu等）表面或金属纳米颗粒表面时，吸附分子的散射截面会被金属表面的局域电磁场剧烈放大，其拉曼散射强度会增加104108倍&SERS技术因快速灵敏、无损，具备分子指纹、专一性和单分子灵敏性的特点，能在分子水平上提供物质、结构的丰富信息，已逐渐成为化学、生物、环境、食品、药物等领域一种强有力的检测手段611）。本文将利用种子生长法合成的均一分散的银纳米颗粒™作为SERS基底，结合便携式拉曼光谱仪器，开展5-FU的检测研究&
2实验部分
2.1
数显智能控温磁力搅拌器（型号SZCL-2，巩义市予华仪器责任有限公司），超声波清洗器（型号KQ5200E，昆山市超声仪器有限公司），低温高速（Sigmal1-16K，Sigma公），十万分之一电子天平（型号EX125DZH，奥豪斯仪器有限公司），场发射扫描电子显微镜（型号FEI Sirion-200，日本岛津公司），紫外-可见分光光度计（型号UV-2550，日本岛津公司），便携式拉曼光谱仪（型号Spk-2-0588，上海如海光电科技有限公司）2.2实验材料与试剂
氟尿嚏睫注射液（旭东海普药业有限公司），柠檬酸钠（AR，上海国药试剂公司），结晶紫（AR，上海阿拉丁试剂有限公司），氢氧化钠（AR，上海国药试剂公司），双氧水（AR，上海国药试剂公司），盐酸（AR，上海国药试剂公司），硝酸（AR，上海国药试剂公司），硫酸（AR，上海国药试
剂公司）
2.3
通过种子生长法合成均一分散的Ag NPs。首先合成种子溶液：将1mL柠檬酸钠溶液（1wt %）,0.25mL AgNOs水溶液（1wt%）和0.2mL NaCl水溶液（20mM）依次加入1.05mL水中，在室温下搅拌预混合5分钟后，将上述预混合物快速加入47.5mL沸水中。加热搅拌1h后，将所得溶液冷却至室温，最终得到亮黄的Ag NPs种子溶液&第二步：使用不同体积的种子溶液合成不同粒径的Ag NPs。将2mL AgNO3水溶液（1wt %）与800!L NH3-H z O混合（25〜28%）制备银氨溶液，用于Ag NPs的合成。将200!L Ag NPs 种子溶液添加到4.73mL水中在室温下搅拌&随后，将70!L银氨溶液和AA水溶液（2mL,2.5 mM）加入上述种子溶液中用与纳米颗粒的生长&搅拌1才、时后，获得粒径约85nm的Ag NPs。将上述溶液离心浓缩后，再分散于柠檬酸钠水溶液（0.02wt%）中保存备用&可以通过调节种子溶液的量合成不同粒径的AgNPs。根据所得到的Ag NPs粒径大小与粒子数浓度的关系，通过改变Ag NPs种子的数量，可以精确地调控Ag NPs的粒径大小。此方法可以通过一锅种子介导生长法在水中合成大尺寸跨度（从40到300nm）的准球形银纳米粒，不需要再使用额外的强稳定剂，并不是多步骤种子介导生长。利用Mie理论可以制备出不和可光的高纳米粒子，从而使我们能够将这些尺寸不同的均匀银纳米粒子扩展到不同的领域&研究结果还表明，形状和尺寸分布窄（例如小于10%）的Ag NPs能够在溶液中实现SERS信号的均匀性和再现性；在空 间和时间尺度上，它们的RSD可以低至5%
&因此，我们制备的形状和尺寸均匀的银纳米粒子的方法可以实现溶液中SERS的定量测定。
2.4SERS基底的制备
抗原呈递细胞
在进行表征以及表面增强拉曼检测之前需要
SERS，成的纳米颗粒、缩处。
留出你过冬的粮食226
光 散 射 学 报第32卷
2. 5银纳米颗粒粒径的选择和基底稳定性研究
由于CV 分子拉曼散射截面大，信号稳定，能 够稳定吸附在
表面，因此 CV (13)作为探针
估SERS 的 果以及稳定性。实验中
选择CV(10-6 M)对三种不同粒径的Ag NPs 的
果 对比# 果最好的作为基
底检测5-FU &其次，滴加10 y L 10-6 M 的CV 至
的基底表面，在室温下自然干燥后，评估基底 的稳定性&
1200900600300
500
1000 1500 2000
Raman Shift(cm -1)
15000
5000
10000
0 500
棒球小英雄1000 1500 2000
Raman Shift(cm -1)
图1 5-FU 拉曼光谱图和SERS 图
Fig.1 RamanandSERSspectraof<-FU
(A )60k
36k 24k
12k 48k
0.0002000
4000
6000
800010000
(C)0k
500
750 1000 1250 15001750
Raman shift(cm )
(D)
图2银基底灵敏度和稳定性研究图谱
Fig.2 CharacterizationofsensitivityandstabilityofSERSsubstrates
200 300 400 500 600 700
Wavelength(nm)
(•n .e )9o u e q j o s q v
图3不同粒径Ag NPs 的光学照片、扫描电镜图以及紫外-可见吸收光谱图&
Fig.3 Opticalphotographs #Scanningelectronmicroscopy (SEM )andultraviolet-visibleabsorptionspectraofAgNPswithdi f
erentdiameter
第3期周国良：表面增强拉曼光谱对抗肿瘤药物5-氟尿咳喘的检测研究
227
(•n.E)A4ISU2UI
(•n .E )A
匸
SU2UI
750
1000 1200 1500 1750
Raman shift(cm -1)
(B) I
y.^kJ)
心
M 2.5k /K_pU^JVA^A —
5000.0k (C)
7.5k
5.0k
2.5k
(•n.E)A±suQAUI
1200 1500 1750
1
3
2
Number
750
1000 1200 1500 1750
Raman shift(cm -1)
图4不同粒径银纳米粒子的 果对比图
Fig 4 ComparisonofEnhancementE f ectofSilverNanoparticleswithDi f erentDiameter
2. 6 抗肿瘤药物5-FU 的SERS 检测
(D5-FU 的标准品的拉曼光谱：将5-FU 注射
液加入比皿中，采集其拉曼光谱。结果如图4。
(2$
的 采集：移取2 !L 缩银
基底放到硅片上，用便携式 仪采集 的
信号，评估 对
的干扰&(3)检测不同浓度的5-FU ：将配制的不同浓
度5-FU 与 ，然后用便携式
仪进行
ctp2000
检测，激发波长为785 nm，激发功率为100 mw，积
分时间为2 s 。得到不同浓度5-FU 的SERS 光谱,
5-FU 的特征光
带。 果如图5。
2.7 血清中5-FU 的检测&4'
将不同浓度的5-FU 加入血清中，摇匀混合，
加入乙醇与血清 (体积比3：1)， 蛋白质
干扰 & 后 上清液与 ，
果如图7。
3结果与讨论
3.1 Ag NPs 扫描电镜表征和紫外-可见吸收光谱
表征
对本实验所制备的Ag NPs 进行扫描电镜测
试。将离心再分散后的Ag NPs 滴在干净的硅片
上，待其自然变干后， 据采集&图3A 、B 、C 是不同粒径Ag NPs 的电镜 图&根据扫描电
镜对其形貌表征结果可知：通过调节种子的量，可 以获得粒径约60〜80 nm 之间的纳米颗粒，且颗
粒 有序，无明显的团聚对
的银纳米颗粒 紫外表征。取一定量的
Ag NPs 加入到比皿中，用紫外可见分光光度计
采集400 nm 〜800 nm 之间Ag NPs 的吸收峰。 纳米粒子的大小、形貌不同,
其产生 峰
的 有所不同，因此可以通过紫外可见 光
其形貌颗粒大小等特点&通过上图可以观
察到本实验制备的银纳米颗粒在488、468、460 nm 处有 峰&根据文献报道，粒径分布在60〜80
nm 之间，与SEM 结果一致&
3.2银基底的筛选
图 4A-C 分别是 700 !L 、1000 y L 和 1200 y L
种子溶液合成的Ag NPs 对10-6 M CV 的检测结
果&如图所示，不同粒径的Ag NPs 均可以实现
CV 分子的可靠 。实验中以1602 cm -1的 度
&如图D ，通过三种不同粒径的Ag
NPs 对CV 检测的特征峰强度对比& 700 y L 种子
溶液合成的Ag NPs (粒径80左右)对CV 的增强
果最好&因此，选用银纳米粒子作为SERS 基底
对5-FU 进行检测&3.3银基底的重复性表征
基底的重复性是SERS 基底可靠性的重要参 数之一&为了考察
的重复性，
实验中选择
228光散射学报第32卷
10-6MC V作为探针分子评估重复性。只有基底具有较好的重复性，才能保证SERS信号的稳定性&CV是一种三苯甲烷类分子，拉曼活性高，在可见有明显的电子光谱&如图3A所示，在基底表面随机采集30条光谱，SERS光谱表现出较好的重现性和稳定性&1585cm-1和1616 cm-1归属于苯环伸缩振动分裂;1370cm-1归属于C-H面内弯曲振动和N-C-环-C-C对称伸缩振动叠加而成!173cm-1归属于苯环上C-H面内弯曲振动模式915cm-1归属于C-H面外弯曲振动模式；803cm-1归属于C-N-C对称伸缩振动模式&验中以特征峰1616cm-1强度，量化基底的均一性&如图3B和3D所示，基底的相对标准偏差在10%左右，因此基底的均一性较好，为后期SERS信号的稳定性和重复性了保障。基于上述SERS谱图，可以初步说明Ag NPs基底对
大&
3.45-FU标准品的拉曼光谱图和SERS图
沸点图A为5-FU标准品的拉曼光谱图，770cm-1拉曼光谱为喀睫环振动，拉曼仪的条件为：波长为785nm、功率为100mw、积分时间2s。
图B为5-FU(25mg/L)的SERS光谱&通过文献调研,5-FU的特征峰归属如下：1234cm-1的谱带归属于C-F伸缩振动；1340cm-1归属于C-H 伸缩振动1400cm-1归属于N-H伸缩振动；1672 cm-1归属于C=O伸缩振动&
图A的拉曼光谱图与图B的SERS光谱图差异较大，可能是因为分子与金属表面之间强烈的化学作用，可分子的对称性甚至电子的改变。这种效应导致相对强度的变化和频移。这种差异还由金属表面电磁的表面则。
3.5不同浓度5-FU的SERS检测图谱
图5为不同浓度的5-FU以及基底的SERS 光谱，图A中51分别是25y g/mL'2.5y g/mL、2.5u g/mL、0.25y g/mL5-FU的SERS特征峰以
的空白峰&根据图A可以得知，5-FU的特征峰不受基底信号影响。图B为四种不同浓度5-FU在1234cm-1特征峰处的强度对比图。
图B的特征峰强度对比可得：5-FU浓度越高，特征峰越强，目前5-Fu的检测限为0.25y g/mL。
(
•
n
.
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A
匸
SU3UI
Raman shift(cm')
5,
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二
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4.0 4.8
5.4
6.0
-log[c]
0k
图5不同浓度的5-FUSERS图
Fig.SERSSpectraof<-FU withDi f erentConcentrations 3.6血清中的5-FU的SERS检测
将5-FU按照标准加入法加入到血清中，配制
不度5-FU的血清溶液&根据优化的前处理
技术，取40n L血清与1204乙醇混合，由于乙醇与水的亲和力大，破坏了蛋白质表面的水滑坡，从蛋白质的溶解度降低，引起蛋白&1为银基底的光谱，2为血清的光谱,3-5分别为血清去除蛋白质后，31.25p g/mL'5.625y g/mL和3.125y g/mL5-FU的特征光谱&如图所示，纯化蛋白之后，血清的特征峰对5-FU的检测不产生干扰&血清中5-FU的检测限为3.125Lig/mL o
J
—
ok
0k------------------------1------------------------------------
5007501000125015001750
Raman shift(cm1)
(
•
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.
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A
匸
SU3UI
图6血清中不同浓度5-FU SERS检测谱图Fig.6SERS Spectra of5-FU with different concen-trations spiked in
去离子水phserum
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