中国生物工程杂志China Biotechnology，2020,40(12):31W0
D O I：10. 13523/j.c b.2009008
新型冠状病毒（SARS_CoV-2)质控品制备*
王国强1>2于菌茵3曾华辉1王旭东3吴玉彬3尚立芝1
李玉林2张怡青u张西西5张振强^王云龙2’4**
(1河南中医药大学郑州450046 2河南省生物工程技术研究中心郑州450002 3河南省职工医院郑州450002)
(4郑州职业技术学院郑州45_5河南师范大学新乡453007)
摘要目的：制备热稳定性好、耐R N a s e攻击及可全程监控操作的核酸检测新型冠状病毒阳性质 控品。方法：分别扩增M S2噬菌体外壳蛋白C P(含P A C位点）基因以及成熟酶蛋白A基因序列 (含核糖体结合位点），先后插入质粒pET28a多克隆位点不同位置，构建通用重组栽体PE T28a/
C P-A。合成包含基因、/V基因和£基因三个靶标的特定核酸序列，插入到重组栽体
PE T28a/C P-A中P A C位点的下游，构建包含靶序列的重组载体PE T28a/C P-A/S。通过原核表达
北京东方集团
系统表达目的蛋白，采用硫酸铵和凝胶过滤层析进行纯化，利用透射电镜和动态光散射对蛋白质
进行物理表征。全能核酸酶消化形成的盔甲R N A，通过R T-P C R检测其残余核酸和热稳定性。
结果：成功构建包含M S2噬菌体外壳蛋白C P基因、成熟酶蛋白A基因和外源靶核酸的重组栽体，
目的蛋白在25尤、IPTG 0. 3mmol /L、诱导14h时以可溶性形式得到高效表达，纯化后，得到了大小
均一、直径为23 ~28n m的病毒样颗粒，经核酸酶消化后R T-P C R检测，颗粒溶液中几乎无核酸残
余且形成了包封靶基因的盔甲R N A。加速破坏试验表明该盔甲R N A无菌过滤后可在37丈稳定
保持10天。结论：在体外，利用M S2噬菌体外壳蛋白和成熟酶蛋白自组装包封外源靶序列制备
滇西1994的盔甲R N A，其热稳定性好，可全程监控整个检测过程，可作为核酸检测S A R S-C〇V-2的定性或定
量质控品。
关键词新型冠状病毒（2019) M S2噬菌体盔甲R N A病毒样颗粒
中图分类号Q816
2019年丨2月以来，在我国湖北省武汉市发现多起病毒性肺炎病例，2020年1月7日，实验室检出一种可感染人类的新型冠状病毒（P属），有包膜，颗粒呈圆形或椭圆形，直径60〜14〇n m[12]。1月20日，我国将新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，S A R S-C o V-2)感染引发的新型冠状病毒肺炎（corona virus disease 2019,C0V I D-19)纳入法定乙类传染病，并采取的预防、控制措施[2]。生
收稿日期:202049>05 修回日期:2020-10-18
*河南省新型冠状病毒应急科技攻关(201100310300)资助项目
**通讯作者，:zhang_zhenqiang@ 126. com;biowyl@ 126.物信息学及形态学分析显示，S A R S-C〇V-2属单股正链 K N A病毒，巢病毒目，冠状病毒科，其基因组全长约29k b，其基因特征与重症急性呼吸综合征冠状病毒(severe acute respiratory s y n d r o m e，S A R S-C o V)和中东呼 吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory s y n d r o m e，M E R S-C〇V)相似，但有明显区别，目前研究显示与蝙蝠 S A R S样冠状病毒（bat-S L-C o V Z C45 )同源性达90%以上[3〜。实时荧光反转录
聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，R T-P C R)以其灵 敏度高、特异性强、适合新发突发传染病、容易普及推广等特点，成为此次突发新发传染病防控中的首推确诊检测方法〜。国家卫生健康委员会印发的《新型冠
32中国生物工程杂志China Biotechnology Vol.40 No. 12 2020
状病毒肺炎诊疗方案（试行第一版-第八版）》，均将R T-q P C R检测新冠病毒核酸阳性为疑似病例确诊的病原学证据之一[8]。
准确、迅速和可靠的检验技术是疫情防控的关键支撑，稳定性良好和能全程监控检测过程的核酸质控品于R T-P C R至关重要，其可为核酸检测试剂盒的高质量研发和生产提供保证W。M S2噬菌体外壳蛋白可包装外源核酸制备成盗甲R N A(armored R N A)，用 作R N A病毒检测阳性质控品。M S2噬菌体外壳蛋白C P、成熟酶蛋白A和包装位点P A C在体外可自组装形成病毒样颗粒（virus-like particle,V L P)，并将 P A C 位点下游的外源核酸组装包封在VI.P中M S2 病毒颗粒由180个化学结构一致的亚基（C P蛋白）和 一分子的成熟酶蛋白（A蛋白）构成1121。包封靶序列 的盔甲R N A因其不能复制，不具有感染性，生物安全性良好，其在形态和结构上与天然病毒相似，耐 R N a s e的攻击，热稳定性好，可从核酸提取、反转录到 核酸扩增过程全程监控，是一种理想的核酸检测质控品[丨31。
在本研究中，分别先后将M S2噬菌体的C P(含 P A C位点）和成熟蛋白酶A基因插人质粒PE T28a 中，
构建重组质粒pE T28a/C P。选取S A R S-C〇V-2基 因组中基因、/V基因和£基因三个靶标的特定核酸序列（339 b P)作为耙检测序列，插人重组载体p E T28a/C P-A，构建重组质粒p E T28a/C P-A/S，重组质 粒在大肠杆菌中诱导表达和纯化，得到目的蛋白，目的蛋白通过透射电镜和动态光散射进行物理表征，显 示在体外自组装形成了 V L P。V L P用核酸酶消化，提 取R N A，通过荧光P C K检测，结果显示V L P包封了外 源的S A R S-C()V-2靶序列。该盔甲丨i N A具有良好的热稳定性，可作为R T-P C R检测S A R S-C〇V-2的质控 品，也可为其他R N A病毒核酸检测质控品制备提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1菌株、质粒和主要试剂克隆菌株D H5a，表达 菌株B U1(D E3)，T载体（含M S2噬菌体基因组）本 实验室前期构建和保存；限制性内切酶/V w丨、I、B a m H1El、T4 D N A 连接酶、D L2000 和 D L5000 核酸Marker购自宝日医生物技术（北京）有限公司，蛋白质 Marker(PageRuler™Prestained Protein L a d d e r，10 to l80k D a)购自赛默飞世尔科技（中国）有限公司，K N A核酸提取试剂盒（K-E4021 )、反转录试剂和荧光探针P C R检测试剂购自苏州华益美生物科技有限公司，B e n z o n a s e核酸酶购自S i g m a公司；其他 化学试剂均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1.1.2引物和探针参考中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所（ivdc.chinacdc/kyjz/ 202001/
120200121 _211337. html)和世界卫生组织(W H O)( https：//w w w.who.i n t/docs/default-source/ coronavimse/protocol-v2-l. pdf? sfvrsn = a9e f618c_2)公 布的S A R S-C〇V-2核酸检测引物和探针序列，挑选并设 计了检测S A R S-C〇V-2三个靶标（基因、/V基因 和£基因）的三对引物和三条探针，同时人工合成靶序 列S(339bP)以及扩增片段的引物，所有引物和探针序 列见表1，探针、引物和靶序列由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
碱的通性
1.2方法
1.2.1重组载体构建含M S2 C P基因和4基因序列 重组载体构建：以T载体（含M S2噬菌体基因组）为模 板，用A-F/A-R引物扩增4基因，C P-V C P-R引物扩增 C P基因。首先用价〇丨和此爪別丨分别双酶切质粒PE T28a( + )和C P基因序列，回收、连接、转化到大肠 杆菌D H5a感受态细胞中，菌液P C R和测序鉴定正确 的重组载体命名为p E T28a( + )/C P。再用Z/ind I D和 A W I分别双酶切重组质粒P E T28a( + )/C P和4基因 序列，连接、转化到大肠杆菌D H5cx中，鉴定正确的重 组载体命名为P E T28a( +)/C P-A。
含S A R S-C〇V-2 /V基因、f)财7r t6基因和£基因特 定核酸序列载体构建：以P U C57载体（人工合成含/V 基因、基因和£基因特定核酸序列）为模板，用 I N-F和I N-R为引物扩增S A R S-C o V-2特定核酸序列S，通过B a m H I和/^d H I分别双酶切重组质粒P E T28a( +)/C P-A和序列S，连接、转化到大肠杆菌D H5a中，测序结果正确的重组质粒命为P E T28a( + )/
C P-A/S0
1.2.2重组蛋白的表达与纯化将重组质粒pET28a (+)/C P-A/S转化大肠杆菌表达菌株BL21(D E3)感 受态细胞，挑取单克隆37T培养至值为0. 5 ~ 〇.7 ，加人异丙基-P-D-硫代半乳糖苷（IPTG)至终浓度
表1载体构建和RT-PCR中用到的引物及探针序列
Table 1Primer and probe sequences used in RT-PCR 引物名称引物序列（5'-3')
2020,40( 12)王国强等：基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒（SARS-C〇V-2)
A-F A-H CP-F CP-R IN-F IN-R
CCCA4CC77TGTAGGTAGCCGGAATTCCA AAGGAAAAAAGCGGCCGCCTATCTAGAGAGCCGTTG CTAGCTVIGCCrrCTAACTTTACTC
CGCGG/irCCTGTTGTCTTCGACATGGGTA
通俗小说CGCC047TCGGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
CCC/14GC7TATATTGCAGCAGTACGCACACA
N-F
N-H
N-Prohe ORFlab-F ORFlah-R ORFlab-Probe
E-F
GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT
CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG
5，-CY5-TTGCTGCTGCTTGACAGATT-TAMRA-3'
CCCTGTGGGTTTTACACTTAA
ACGATTGTGCATCAGCTGA
5，-ROX-CCGTCTGCGGTATGTGGAAAGGTTATGG-BHQl-3 ACAGGTACGITAATAGTTAATAGCGT
E-R ATATTGCAGCAGTACGCACACA
E-Probe y_FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-BHQ2-3，Note：The bold part in italics of PEDV-F primer is the BamW I digestion site; The bold part in italics of PEDV-R primer is the Hind I D digestion site；The bold part of the PEDV-Probe probe primer is a fluorescent reporter group ( FAM) and a quencher group ( B H Q1 )
丁晓君天女散花0.3m m o l/L，25T l振荡诱导表达 M h。用 2〇mniol/L Tris (含 l O O m m o l/L N a C l，0. 1%N P40，p H=8.0)缓冲液 A 重悬菌体，超声破碎（200W，工作10s，间歇l〇s，超声 2〇m in),12 000 r/m i n离心l O m i n收集上清。搅拌过程 中缓慢加人饱和硫酸铵至终浓度为30%,41搅拌30m i n,12 000r/min 离心收集沉淀,20m m o l/L Tris(含 100m m〇l/L N a C l，P H=8.0)缓冲液B重悬沉淀后，放人 透析袋中，用2L缓冲液B除去硫酸铵。透析后样品通 过Sephacryl s-1000凝胶过滤层析柱进行进一步纯化。
1.2.3病毒样颗粒的物理表征硫酸铵沉淀和凝胶 过滤层析纯化的病毒样颗粒，〇.22p m针头滤器过滤后，一部分样品通过Zetasizer Nan。Z S E纳米粒度仪（马 尔文）检测颗粒均一度；另一部分纯化的颗粒在2%磷 钨酸复染，l〇〇k V加速电压条件下，通过J E M-1400(日本）透射电子显微镜，观察颗粒粒径。
1.2.4病毒样颗粒残余核酸去除取0.5m l凝胶过滤 层析纯化后的病毒样颗粒加人终浓度为2tmn〇l/L的 种子包衣剂
MgCl2，同时加入500U的Benzonase全能核酸酶，在 371条件下消化8h。取消化后的病毒样颗粒100^1，用R N A核酸提取试剂盒提取R N A，后反转录获得c D N A。分别以核酸酶未消化的病毒样颗粒、消化后的病毒样颗 粒和反转录后c D N A为模板，用探针法P C R进行检测。
1.2. 5 盔甲R N A拷贝数确定用NanoDrop O ne/ O neC微量核酸蛋白浓度测定仪（Thermo)测量重组质粒PET28a (+ )/C P-A/S的浓度，按照公式：样品Copies/pl =阿伏伽德罗常数（6.02 X1023)拷贝数x 浓度（ng/jil x 10_9)/重组质粒平均分子量（DNA length x660)计算重组质粒PET28a( + )/C P-A/S的初始拷 贝数。对重组质粒进行10倍系列稀释，分别以各个稀 释度为模板，以E基因（FA M通道）引物对和探针进行 P C R扩增，建立标准曲线。同时，通过标准曲线确定病毒样颗粒包封SARS-CoV-2特定核酸拷贝数。
1.2.6病毒样颗粒稳定性检测取3m l核酸酶消化后的病毒样颗粒,〇.22p m针头滤器无菌过滤后，分为5 份，每份600|J。一份4弋放置，剩余4份37T分别放置 5d、10d、丨5d和20c i，20d后，一起进行样品裂解提取R N A、反转录和荧光P C R检测，比较其C t值变化。
34中国生物工程杂志Chi丨ia Biotechnology V〇1.40 No. 12 2020
2结果
2.1重组载体的构建
以T载体（含M S2基因组）为模板，用A-F和A-R 引物扩增/I基因（1 211bp) ,C P-F和C P-R引物扩增C P 基因（441hP)；以PU C57载体（人工合成含/V基因、O f t W M基因和£基因特定核酸序列）为模板，用IN-F 和1N-R为引物扩增S A R S-C o V-2特定核酸序列S (339bP)(图la)。按照图2所示，C P基因J基因和S A R S-C〇V-2核酸特定序列S按先后顺序插人质粒PET28a( +)多克隆位点不同位置，构建了重组质粒: pET28a( + )/C P、pET28a(+ )/CP-A 和 pET28a( + )/ CP-A/S。重组质粒pET28a( + )/C P-A/S分别通过施I 和fi«mH I双酶切、W，>k1IU和/V o t|双酶切、B a m H I 和//indin双酶切，得到与预期大小一致的C P基因 (441b p，图 l,b 泳道 1)、4 基因（1 211bp，图 l，b 泳道 2)和S序列（339bP，图l,b泳道3)。
(a)
图1重组质粒构建和鉴定
Fig. 1Recombinant plasmid construction and identification
(a) Target sequence PCR amplification M：I)NA marker ( DL2000 );1-3 ： Respectively CP gene, A gene and S sequence ( b ) Recombinant plasmid digestion identification M： I)NA marke ( DI^OOO) ； 1 -3 ： Respectively, CP gene,/I gene and S sequence double digestion
C C C T G T G G G m T A C A C T T A A A A A C A C A G T C T G T
ACCG TCTG CG G TATG TG G AAAG G TTATG G C TGTA
G n G T G A T C A A C T C C G C G A A C C C A T G C n C A G T C
图2共表达质粒的表达区域结构示意图及插入序列
Fig. 2 Schematic diagram of the expression region structure of the co-expression plasmid and insert sequence
2.2目的蛋白的表达和纯化
表达菌株 BL21(D E3)/pET28a( + )/C P-A/S 经过 I P T G在251低温诱导后，超声破菌，上清经30%的硫 酸铵沉淀，沉淀重悬，过分子筛进一步纯化。如图3所 示，经过诱导后，A蛋白（44k D a)有1/3在上清中以水溶性形式表达，C P蛋白（14k D a)几乎全部以可溶性形 式表达（图3a，泳道1 )，上清经30%的硫酸铵粗纯后，去除了一部分杂蛋白（图3a，泳道3)，经过分子筛进一 步纯化后，目的蛋白纯度大幅提升，同时，A蛋白含量 远低于C P蛋白（图3a，泳道4)
。纯化的目的蛋白通过
2020,40( 12)王国强等：基于MS2噬菌体病毒样颗粒的RT-PCR检测新型冠状病毒（SARS-C〇V-2)35
图3目的蛋白的纯化和鉴定
Fig. 3 Purification and identification of target protein
(a) The SDS-PAGE of target protein protein M： Protein marker ( 10-180kDa) ；1：The ultrasonic supernatant of bacterial cells；2：The ultrasonic-precipitation of bacterial cells; 3：The resuspend supernatant after precipitation with 30% ammonium sulfate；4 ：The target protein after purification by molecular exclusion chromatography (b)T h e HPLC detects the purity of the target protein
H P L C进一步检测，纯度在90%以上，目的蛋白的保留 时间为15min，进一步说明目的蛋白为大分子聚合物(图 3b)。
2.3病毒样颗粒的物理表征
硫酸铵和凝胶过滤层析纯化的大分子目的蛋白通过粒度分析仪检测蛋白质粒径和均一度，结果显示：粒 径为24m n左右，且均一度良好（图4b)。同时，目的蛋 白稀释后，通过透射电镜观察粒径，形成的病毒样颗粒粒径在23〜28nnl，与野生型M S2噬菌体大小一致（图4a)。
图4病毒样颗粒的物理表征
Fig. 4 Physical characterization of chimeric epitope nanoparticles
(a) Electron microscope observation ( b) DLS detection
2.4病毒样颗粒酶消化去除残余核酸
纯化的病毒样颗粒含有大量重组质粒和大肠杆菌核酸，为了消除残余核酸对后续P C R检测的影响，将纯化的病毒样颗粒经全能Benzonase核酸酶消化后，直接作为模板进行荧光P C R检测，C t值为39.21，未消化的病毒样颗粒作为模板，其C t值为31.45，而 核酸酶消化后的病毒样颗粒，经过R N A提取、反转录 和荧光P C K检测，C t值为25. 31。结果表明：纯化
的
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