2013设计实验
稀有金属材料与工程
鲎血液中血蓝素的提取与检测第五种快乐
一．实验目的
学习血蓝蛋白提取与检测的原理及应用，掌握血蓝蛋白提取与检测的装置及其操作方法。 二．基本原理
血液有各种各样不同的颜，这是因为血液中所含的素物质使得其血液呈现出特定的颜。如人和脊椎动物的红血液，虾等节肢动物的青血液。
鲎（hòu），一种堪称“活化石”的古老海生节肢动物，却拥有蓝的血液。而使其血液呈现出
e人e本t6奇异蓝的物质，就是本次试验所要提取的——血蓝素。
时域分析 血蓝素又称血蓝蛋白，是节肢动物和软体动物血淋巴中的一种多功能蛋白。其功能与血红蛋白功能相似，但是载氧效率比血红蛋白低。过去被称为呼吸蛋白，但最新研究表明， 血蓝蛋白不仅是一种含铜呼吸蛋白，而且还是一种重要的免疫分子。该蛋白参与了能量储存、渗透压维持、蜕皮过程调节,特别是酚氧化物酶活性和抗菌等生物功能的执行。进一步研究血蓝蛋白功能对于丰富和发展无脊椎动物，特别是甲壳类动物生理生化和免疫系统的基础研究，探索免疫这些结果表明，血蓝蛋白具有广谱抗细菌、真菌、病毒功能及独特的作用机理，有可能成为抗菌、抗病毒及抗肿瘤药物的新来源。中国是海洋大国，开发和利用海洋动物血蓝蛋白资源，将为研制抗菌新药提供理想分子设计骨架和模板，为发展新的抗感染药物奠定重要基础。
提取与检测血蓝素的实验原理如下：
血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，与含铁的血红蛋白类似，它易于氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿，还原时呈白。其分子量450 000～130 000。节肢动物的血蓝蛋白一条多肽链与一分子氧结合，含铜量0．1
势力范围
7%；铜以二价形式与蛋白直接结合。
利用超高速冷冻离心和Sepharose 4B凝胶过滤两步法从日本血吸虫中间寄主-湖北钉螺血淋巴中提取获得一种含铜呼吸蛋白-钉螺血蓝蛋白.该血蓝蛋白具有典型的血蓝蛋白基本特征,含铜量为0.23%,在340nm处观测到该蛋白的紫外特征吸收峰.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测该呼吸蛋白由两种蛋白质亚基组成,分子量分别为400KDa和250KDa.透射电子显微镜测定结果证实其四级结构为中凹的圆柱体,且以单体、二聚体和多聚体形式共存于血淋巴中. 三．实验材料
美洲鲎Limulus polyphemu'（东方鲎为我国二级保护动物，故不可用）。
四．实验仪器于试剂
高速冷冻离心机，冰箱，垂直板电泳槽，电泳仪 ，精密电子天平，移液，恒流泵，Tris-HCl，CaCl2，MgCl2，20%蔗糖，Sepharose 4B 悬浮液等。
五．实验内容与步骤
1.血蓝素的提取
每只鲎都将被固定，然后使用不锈钢针刺入鲎的心包以提取输往心脏的含氧血（鲎并不会因为血液提取而死去）。放于装有 0.1ml 左右储存缓冲液（0.05M Tris-HCl 含 5mM CaCl2、5mM MgCl2，pH7.0）的离心管内，后用高速冷冻离心机 8000 r/min4℃离心 20 分钟，将其上清液（含血蓝蛋白）转移到新的离心管内，就得到初步提取的鲎血蓝素溶液。
2.血蓝素的纯化
（1）取收集的鲎血蓝素粗提液
用超高速冷冻离心机于 4 °C 、190000g 离心力，离心 3.5 小时，弃去上清液，所得沉淀溶于 0.05MTris-HCL（pH7.0）缓冲溶液中(含 5mMCaCl2，5mMMgCl2，20%蔗糖)。存于-20℃冰箱中备用。
（2）Sepharose 4B 凝胶过滤柱层析
装柱：垂直固定好层析柱，柱底放置一层支撑网，然后一边搅拌一边缓慢而连续地加入 Sepharose 4B 悬浮液，让其自然沉降，直至沉积达 60 ㎝ 高。（装柱要求连续、均匀，无纹格、无气泡，表面平整，液面不得低于凝胶表面，以免混入空气而影响分离效果。）
上柱：将样品溶液在洗脱剂的液面恰好与凝胶床的表面相平时加入凝胶层析柱，使2组分能够均匀地进入凝胶床（样品溶液体积不能过大，通常为凝胶床体积的10%左右，最大不能超过 30%）。打开开关，使样品溶液进入凝胶。
洗脱：吸少量缓冲液（0.05M Tris-HCl 含5mM CaCl2、5mM MgCl2，pH7.0）冲洗柱内壁2次，加洗脱剂至液层3~4㎝左右，接上恒流泵，调好流速（0.2ml/ min），开始洗脱。所用洗脱剂体积一般为凝胶床体积的120%左右，洗脱流出液用部分收集器收集，收集组分的大小为1ml/管。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议