c805导弹第42卷第-期
2201年4月分析测试学报FENXI CESHI XUEBAO(Bvyai of Wctymenwl Analysis )Vol. 42 No. 4595〜599
doi : 10. 3966/j. issn. 1004 -4957. 2221. 04・ 010
刘润卿24 ，孙洁芳4 ，牛宇敏4 ，单文宠25 ，邵 兵10*
*收稿日期：2222 -10-22；修回日期：2201 -20 -22
基金项目：首都卫生发展科研专项(221-4-1214)；国家重点研发计划食品安全关键技术研发重点专项(221YFC1622602)；北京 市城市管理能力提升专项重大项目(D17 1 1200085 532 1 )
*通讯作者：邵 兵，博士，研究员，研究方向：食品污染物分析,E - mail : sUaoVinycO@ sine, com
体能训练服(1.首都医科大学公共卫生学院，北京100066 ； 2.北京市疾病预防控制中心食物中毒诊断溯源技术g
京市重点 实验室，北京 10418; 3.中国农业大学动物医学院北京食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京 10123)摘 要：一直以来毒蘑菇中毒在全球范围内频发，成为最常见的食物中毒事件之一，也是食物中毒致死的最 主要原因。毒蘑菇中含量最高、致死性最强的毒素为鹅膏毒肽。因此，鹅膏毒素准确快捷的检测对鉴别中毒 源、患者后续及预防有着重要意义。目前，鹅膏毒肽的常用检测方法包括谱-质谱联用技术以及一些 基于免疫识别和特殊化学结构的检测技术。而不断开发特异性强、灵敏度高、检测时间短的新型检测方法仍 是目前的研究热点和重点。该文就鹅膏毒肽的检测方法进行综述，以期引起研究同行对此领域的关注，以激 发更多的研究思路。 关键词：蘑菇中毒；鹅膏毒肽；质谱；快速检测；研究进展
中图分类号：O629.72； G353.( 文献标识码：A 文章编号：504 - 4957(2061 )04 - 0503 - 07
Resecn/ Proyresu in Detection MetWobf for Amatoxin
LIP Run-biny 1,0 , SUN JieGang 2 , NIP Yu-min 0 , SHAN Wen-cOony 0,5 , SHAO Bing 1,2*
(1. School of Puh/c Health , Capibi Medical University , Beping 100066 , Chi/a ； 2. Beping Key Ladoratoy of Diaguos/c and Traceabi/tp Tech/oloyies for Food Poiso/iny , Be/ing Ce/ter for Disease Preve/Oox and Co/tnl, Beping 50013 , China ； 3. Be/ing Adva/ced In/ovatiox Ce/ter for Food Nutrihox and Human Health , Colleye of Veteri/ay MeCici/e ,
Chi/a Agricoltural U/iversitp , Beping 100123 , Chi/a)
Abstract : Mushnom poisoning occurs fyquentla a ll over the world , which das Oecoma one of the most common food p oisoviny events : as well as the main cause of death from food poisoviny. Meant while , the most and deab/esf toxin in the poisonovs mushroom is amatoxin. Hence , rapib and ”(//(rata detection of amani/n is o f great significance Ux the bentiScatiov of toxic source , and the sudsct quent treatwent and p revvntiov of patients. At present , the common methods tr amanitin detection mcludc chymatoyrapha - mass spectnmety and soma other detection Wchniquas Oased on immuno recoyni/ov and special chemical stwictuns. It is still the focus of corrent research that the UeveUpt mant of new UeWcOon mathobs with stnng specificity : high snsidvity and Uw Omv-covsumpOov .Therefore , the detection methods of amanitin are reviewed in this pafar in order to annse the 0)— Won of research coimayucs in this Ueld and stimulate more research ibeas.
Keywords ： mushnom poisobiny ； amatoxin ； mass spectnmety ; rapib detection ; research pyt gnss
毒蘑菇中毒是最常见的食物中毒之一，也是食物中毒致死的最主要原因［］。一直以来，全球范围 内
毒蘑菇中毒事件频发。599年~2216年发生在美国的蘑菇接触病例共有183 702例［］。意大利［］、 瑞士⑷、爱尔兰［］等世界各国也时有发生毒蘑菇中毒事件。我国的云南、广西、四川地区毒蘑菇中毒 发生率也较高，且多发于夏秋季。2212年~225年云南省毒蘑菇中毒人数占同期全部食源性疾病爆发 事件发病总人数32. 37% (9 682/31 592)，占总死亡人数57. 02% (225/k57) ［］。2212年~2213年江西 省毒蘑菇中毒人数占同期食源性疾病爆发事件发病总人数18. 2% (423/3 575)，占总死亡人数52. 0% (19/23)［］。毒蘑菇中毒发生率和病死率高，亚洲中毒患者后病死率仍可达2& 2% ［］；发病快, 临床表现多样，一些毒蘑菇中毒起病急、进展快、预后较差，因此患者中毒后及时进行毒蘑菇毒素的
504分析测试学报第4卷检测，
者的和预后至关重要。 技的发展， 的检测方法不断推陈出新，新兴的检测技术 蓬勃发展，为灵敏、 、高效的毒 毒素检测 的技术支持。1蘑菇毒素的分类及中毒机理
毒 众多，且与可食 ， 食而中毒。其中，大部分致 毒 毒素为鹅膏肽类毒素。根据其氨基酸的组成和结构又分为5种鹅膏毒肽(AMA )、7种鬼笔毒肽和2种毒伞
。鹅膏毒肽是一 环八肽, 与启动环上的组氨酸残基Hisl035结合1-3]，专一 制 生物DNA 聚合酶U 活性，导致其无法进行正常转录和细 蛋 合成，从而诱发细 和肝功能衰
11]o 鬼笔毒肽是双环七肽，毒伞素为单环七肽，两者专一性的与细胞中肌丝蛋白结合，破坏肌球蛋 白与肌丝蛋白正常的聚合-解裂过程12，从而削弱细胞膜的功能，导致机体中毒。在致死性鹅膏肽类 毒素中，致
强、含量最高的为a 和炉鹅膏毒肽，因此 毒 毒素的检测 为 鹅膏毒
肽的检测。图1鹅膏毒肽的化学结构(A)及不同种类鹅膏毒肽的取代基与半数致死量(B)
Fig. 1 C/emicot strvctups of the amatoxin veCants( A) , and R-3Pxp desig/aho/s for eack veCant and
Xs mehian Othet dose ( B )
B
Amanitin
东北电力大学成人教育学院
叫r 2R 3 R 4R5 (mg/4g)a-AMA
ch 2oh OH nh 2OH OH 0*.60-AMA ch 2oh OH OH OH OH
0.5y-AMA ch 3
概念模型设计OH nh 2OH OH 0.2 〜0.52检测技术进展
2. 1鹅膏毒肽的谱及其联用技术进展
型仪器的 及其 技术 进样量少、灵敏度高、准确可靠的优点而在鹅膏毒肽的
检测中发挥了重要作用。 方法由于样品 理复杂、仪器操作技术要求高，不适 场快速筛查。
2.1.1毛细管电泳检测 毛细管电泳(CapiXap electpphopsis : CE)检测是一类以毛细管为分离通道、 以高压直流电场为驱动力的液相分离、分析技术。Bruggema/u 等13] 尝试 细管 电泳定量者尿液和毒蘑菇提取物中的a 和炉鹅膏毒肽。该方法分析需20 mix ，检出限为1 a g/mL 。Rittyen 等14 建立了一种分离鬼笔环肽、a 、炉和Y 鹅膏毒肽的CE 方法，优化后方法检出限为3〜79 ug/mL 。 Robinsox - Fuentes 等15]建立的CE 方法, 7 mix 内测 液中的a 和炉鹅膏毒肽。分离
为毛细管间距75 am , 长度41 cm ，总长度43 cm , 25 °C , 20 hV , PDA 检测波长为214 mn 。该方法的检 为1.5 ng/mL ，定量下限为5 ng/mL ，在5〜34 ng/mL 范围
良好线性和选择性。2.1.2气相谱检测 气相 (Gas chmmPooruhy ； GC)检测是一种分离、分析技术。 惰性气体作为流动相，使样品组分在流动相和固定相之间瞬 到平衡，是一种分析速度快、分离效率高 的分离分析方法。ScUwarzOver 16]采 -气相 河 毒 毒素进行鉴定和分类， 分析 、热辅助水解和甲基化，建立毒 的 库，对鹅膏毒素的检 可达3.5 m 。2. 1.3 高效液相谱检测 高效液相谱(Hi/ pemormucc liquih chpmatogra/hy ； HPLC)检测技术以 液体为流动相，采用高压输液 ， 的单一溶剂或 的混合溶剂、
液等流
第0期刘润卿等：鹅膏毒肽检测方法的研究进展573
动相泵入装有固定相的谱柱，各成分在柱内被分离后，进入检测器进行检测。Jehl等［0］研究了一种HPLC测定人血清、尿液和胃液中a和0-鹅膏毒肽含量的方法。该方法在反相分析柱上进行分离，在287nm紫外检测条件下定量检测，a和0-鹅膏毒肽的检出限均为5ng/mL。AbOoh等［5］开发出一种HPLC方法检测尿液中鹅膏毒肽的含量，为了更精确的定量，通过同位素内标法定量a鹅膏毒肽，其内标为5叫0二-鹅膏毒肽，而0-和Y鹅膏毒肽不使用内标具有更一致的定量，检测样本的a、0-、y鹅膏毒肽的检出限分别为2.458、2.932、2.59ng/mL。Gania等［4开发并验证了一种HPLC紫外二极管阵列(Dmdeaoay detector,DAD)和电化学检测的方法，用于定量大鼠肝脏和肾脏中的a鹅膏毒肽，检测步骤简单、快速，适用于研究a鹅膏毒肽的药代动力学和组织分布。Morel等［4］采用HPLC在294nm 对蘑菇中的a和0-鹅膏毒肽进行分析，检出限分别为22.5、29.0ny/mL，回收率为83.2%~54.8%。
Li等［1］设计了一种分子印迹聚合物(MoUcuUr impOntby poUmers:MICs)作为HPLC固定相，具有识别和富集a鹅膏毒肽的作用，通过HPLC分析检测血清中a鹅膏毒肽的含量，检出限为3.2ny/mL，线性范围为12-572ny/mL，回收率为8&5%~95.9%。因为MU特异性识别界面的存在，即使在复杂
的样品基质中也表现出对目标物良好的选择性。
2.1.4液相谱联用质谱检测液相谱与质谱联用技术(Liquid chromaWyraphy-mass spectnmety,
LC-MS)利用液相谱作为质谱的进样系统，使复杂的化学组分得到分离，利用质谱作为检测器进行定量和定性分析，可提高检测方法的灵敏度。国营农场
L等开发并验证了一种灵敏、经济的LC-MS/MS法检测血清中的a鹅膏毒肽，检出限为3.0 ng/mL。Li等使用液相谱-光电二极管阵列检测-离子阱和飞行时间质谱(Liquid
cUomOoyopda-photoVioPa OTay detection一ion trap and Oma-of-FUh-mass spectnmety:LC一PDA-IP-TOF-MS)可实现同一样品中多种鹅膏毒肽的准确识别检测，该研究对毒素的裂解途径和特征片段离子进行深入研究，获得了更好的检测效果。
Wang等㉔建立了一种应用固相萃取柱处理样品，测定蘑菇样品中蘑菇毒素(包括a、0二Y鹅膏毒肽等)的LC-MS方法，检出限可达2.23mg/kgo Xu等应用在线固相萃取/高效液相谱-三重
四极杆质谱联用技术(So/P phase extraction/kign peWbonanco/qiUP cUymOoyoppy-tWpla quOrupolv mass
spectnmety ,SPE/LC-MS/MS)建立了超痕量a和0二鸟膏毒肽的分析方法，检出限均为2.22ny/mL，线性范围为2.25〜22ng/mL。Zhang等［0］利用超高效液相谱-串联质谱(Ultrabigh perfoonanco liquib cUomOoyophy-tandem mass spectnmety:UPLC-MS/MS)联合固相萃取柱PRiME HLB洗脱平台，简
单、高通量地分析血浆、血清和尿液中3种鹅膏毒肽(a、0二Y鹅膏毒肽)含量，实现了血浆中3种鹅膏毒肽低至2.9ng//的检测。
Tan等设计了一种基于0-环糊精协同MIC识别的固定相，应用UPLC-MS/MS方法实现血清、尿液以及肝脏中a、0-和y鹅膏毒肽的同时检测，在尿液、血清、肝脏中的检出限分别为200~2.33 ng/mL, 2.32-2.02ng/mL和2.235~2.256ng/kg，分析速度缩短至8min。
Xu等43制备了一种新的反相/苯基硼酸型混合模式磁固相萃取(Magnetic solib-phase extraction, MSPE)吸附剂用于UPLC-MS/MS法检测鹅膏毒肽(见图2)。该方法的基质效应较低，灵敏度高，检出限低(2.3a g/kg)，从称重、富集、纯化到检测，在22min内即可完成一次样品的检测。该研究研制出一种吸附蘑菇等样品中鹅膏毒素的MSPE材料，用硅烷化的POSS对氯甲基化微球(Fe3O7@SW2)和磁性微球进行改性，将3-苯氧基苯甲醛和4-甲酰基苯甲酸偶联，制备了RP//BA复合型磁性微球(Fe3O4@Sd)2@POSS@POB@PBA)，使设计的吸附剂表面与目标物的结构相匹配。该吸附剂具有较大的吸附容量和良好的目标选择性，在使用过程及使用后很容易通过磁分离，样品前处理过程简单、快速、高效，并有效地降低了LC-MS/MS测定中的基质影响。
507分析测试学报第4卷
Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA Fe3O4@SiO2@POSS-NH2
图4特异性识别捕获鹅膏毒肽的分子印迹材料构建(A)；磁性Fe3O4@SiO2@POSS@POB@PBA微球吸附剂特异性回收基质中鹅膏肽毒素及其后续与UPLC-MS/MS的联用检测示意图(B)15］Fig.4CoxsWpctiox of moOc/mCy impCnteh matecats thet specificalty identim amatoxin(A-；sc/ematic diagram of maguetic Fc3O4@SiO2@POSS@POB@PBA micpsphep a/sordent specifio recovep for amatoxin in matWo and
its subseqpe/t detectiox combi/eh with UPLC-MS/MS(B)1统
2.2鹅膏毒肽的快速检测技术进展
2.2.1基于鹅膏毒肽理化性质的快速检测鹅膏毒肽基于理化性质的检测技术主要有显反应、吸收光谱检测和荧光检测。方法一定的化学衍生实现鹅膏毒肽光的变化，简单、快捷的优势，敏度低、特，需与其他技术。Wieland等14］发一种简检测方法，将鲜液纸上，干透后滴加，鹅膏毒肽毒素则14mX|。虽操作简单，敏度低，定量，仅可能适野外采的初步鉴定.▼0$0/等14］研究了一荧光光谱快速检测鹅膏毒肽的方法，鹅膏毒肽加入漠化乙睫后会产生新的荧光
而实现检测。
56个民族简介
纸层析和薄层层析(Thio layer chpmatogra/hy；TLC)技术溶质与固定相和流动相之间作用的，实物固
定相上的分离。Wieland等⑶］纸层析技术分离检测毒素，层析结果采用1%的气体中的显反应进行检测。Sullivan等16］］采用薄层层析法分离检测a、炉和Y鹅膏毒肽。Styvi等13］建立了一种快速、灵敏、高效的薄层法测定鹅膏粗提取物中a、汗和Y鹅膏毒肽含量，每种鹅膏毒肽的检出限为54m。
2.2.2基于免疫识别的快速检测免疫识别检测利用抗原抗体特异性识别对目标物进行检测，具有特异性好、灵敏度高的优点，交叉反应存在，也需考虑。放射免疫检测法(Ranmim( mumassay；RIA)是放的测量方法与免应的基本原理相结合的一种放检测法。FauOPch等12］将鹅膏毒肽的衍生物与胎球蛋白结合作为兔抗原，低的毒性和较高的免疫原性，所获得的与其他鹅膏毒肽不产生交叉反应。RIT提取纯化的TG结合在活化的面，时共？化的鹅膏毒肽免蛋白进行免疫检测，以生物中目标物的检测，检为3m/mL°RIA敏度高、特强、等优点，时格、放人体存在潜等缺点。
免测定(EmymeTOdey immumsorbe/t usay；ELTA)技术具有灵敏度高、特异性好、简单快捷等优点。Abub/eska等15］在绵羊体内制备炉鹅膏毒肽血清，构建接免疫吸附测定法((ndirect comuetitivy enzyme-linheh immu/osorbent assay；ic-ELTA)测定人血清和尿液中的毒素，检为统pg/mL，与a鹅膏毒肽的交叉反应性为22%。He等16］研究了一鹅膏毒肽的特，鹅膏毒肽蛋白与包衣抗原与结合，该方法对a A价和y 鹅膏毒肽的检出限分别为4.55、4.90、4.45ng/mL。
Bever等17］应向流动免疫分析(Lateral bow immupoassay；LFIA)技术快速检测尿液中的鹅膏毒肽，在3mix内即可完成检测，且无需对尿液进行任何预处理，对比和广鹅膏毒肽的检为
ng/mL，价鹅膏毒肽的检为1j/mL。
Zhang等1统开发了一种快速、简单的新型表面等离子体共振(SuCPcc plasmox resoxa/cc,SPR)免疫
第0期刘润卿等：鹅膏毒肽检测方法的研究进展576
检测鹅膏毒肽的方法，构建单链可变区(Singta-cOain vaWabla fragment,scFv)噬菌体抗体库，筛选并分离了对鹅膏毒肽具有高特异性的重组抗体scFv-A2，以该抗体为基础，所开发的SPR传感器免疫检测的灵敏度为d-ELISA法的5倍左右，检出限为2.5ng/mL。该方法抗体制备简单、重复性好，可快速提纯，提升了免疫分析的灵敏度。
Ha等［5］同样基于重组单链可变片段抗体scFv-A2，开发了以胶体金作为红标记的快速免疫层析法(ColUibal gold immunochymatoyraphy assay,CG-ICA)，可在12min内完成检测，实现了现场快速半定量测定蘑菇样品中的鹅膏毒素。CG-ICA是一种基于竞争反应原理的快速半定量检测方法。样品中的鹅膏毒素与测试线上固定的a鹅膏毒肽-OVA结合物竞争结合胶体金标记的抗体。与传统的多抗或单抗CG-ICA相比，该方法制备的试纸价格低廉，重复性好。
2.2.3基于特异性基因片段的检测技术Wthoszyn等⑷研究了一种基于基因编码鉴定毒蘑菇中鹅膏毒肽的通用方法提取毒蘑菇中的DNA，再进行聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)扩增，用
于检测鹅膏菌属。He等［71］建立了基于锁式探针(PadUch pyba,PLP)的超支化滚动环扩增(Hypew OrancOeC nhing cinta amplification,HRCA)技术，用HRCA等温法鉴定蘑菇混合物中的致命鹅膏毒肽，灵敏度比传统PCR法高52倍。HRCA是一种等温的指数扩增技术，通过逐个引物延伸和链置换的级联反应，快速测定特定的核酸序列。挂锁探针为大约52个碱基的单链线性寡核昔酸，由两个序列组成，与目标序列的5，和3，端互补，并由遗传连接区连接。当与目标杂交时，探针的5，和3，末端并列，并连接形成一个闭合的环状分子。环状探针可以在等温条件下用DNA聚合酶进行HRCA指数级扩增。所设计的聚合酶链反应能够识别所有的a鹅膏毒肽基因序列，并能产生阳性HRCA反应，最终加入SYBRGnenl诱导荧光产生，令HRCA结果无需琼脂糖凝胶电泳即可直观读出，大大降低了气溶胶污染的可能性。该方法无需昂贵的设备，可直接读取信号，从而为条件较差的实验室和偏远地区的快速筛查提供了一种快速、特异、灵敏且经济有效的工具。
2.2.4基于分子印迹传感器的快速检测基于分子印迹传感器的快速检测以MIC实现的特异性分子间作用力或立体结构作为识别基础，搭建各种传感界面，应用不同信号传导方式，实现基质中痕量鹅膏毒肽的识别、富集和检测，具有快捷、可视化、高特异性和高灵敏度等特点，以满足不同情况下的检测需求。
Feng等⑷］将碳量子点(Cardon quantum dots:CDs)嵌入印迹聚合物制备了特异性识别的荧光传感器，用于直接检测血清中的a鹅膏毒肽，方法检出限低至5ng/mL。MIP中竣基和毗呢官能团可通过协
同识别作用提高MU对a鹅膏毒肽的识别、捕获能力，所制备的荧光传感器无需任何预处理即可选择性、灵敏地检测血清中的目标物。
Qb等［4］建立了一种基于石英晶体微天平分子印迹(QCM-MIC)传感器用于检测生物样品中的鹅膏毒肽。首次利用烯丙基硫醇在QCM金电极表面附着可聚合的双键，以合成的a鹅膏毒肽为模板，4-乙烯基毗呢和A-甲基丙烯酸为双功能单体，在金电极表面沉积MIP涂层。所构建的QCM-MIP对a 鹅膏毒肽具有良好的吸附性能，且重复性和稳定性好，在1.0-54.0ny/L范围内具有良好的线性响应，检出限可达2.252pg/L。
Qb等将MIC捕获界面与光子晶体模板相结合，制备了MIC光子晶体传感器(MICC)，可实现2 mu内对食品基质和生物基质中a鹅膏毒肽的检测，方法具有可视化、重复性好、灵敏度高等优势(图3)o该工艺以合成的部分a鹅膏毒肽为模板，二氧化硅胶体光子晶体为载体，甲基丙烯酸(MMA)为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸(EDMAA)为交联剂，所合成的MIPC在乙醇溶液中与a鹅膏毒肽吸附结合后能够引发衍射峰发生位移，实现光学检测。所制备的MIPC传感器线性范围宽(5-5~12-5mg/L)、检出限低(5.2X/-1mg/L)、响应时间短(2min)，在识别过程中伴随着MIPC膜的颜变化，从而实、血、液中敏的可视化检测。
表1列出了近年来对鹅膏毒肽进行检测的方法对比。
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