土 壤(Soils), 2011, 43 (3): 343~349
宋 洋， 王 芳， 蒋 新
（土壤与农业可持续发展国家重点实验室（中国科学院南京土壤研究所），南京 210008） 摘要： 1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）的微生物降解机制包括好氧降解、还原脱氯和共代谢。本文简要综述了国内外对1,2,4-TCB微生物降解方面的研究进展，分析了其微生物降解的可行性，讨论了其好氧降解的微生物种类以及降解途径，阐述了厌氧条件下，混合菌以及纯菌株对1,2,4-TCB还原脱氯的过程，目的是为1,2,4-TCB污染土壤的微生物修复提供依据。 第六次人口普查
关键词： 1,2,4-三氯苯；好氧降解；还原脱氯；共代谢
中图分类号： S154.3; X5
1,2,4-三氯苯（1,2,4-TCB）属于氯苯类化合物，工业用途广泛，主要用作化学制造的溶剂、印染载体、农药合成、绝缘添加剂、脱油脂剂、润滑液和电解液等[1]。2005年我国 TCB 的生产量为5 000 t，欧盟仍生产1,2,4-TCB 5 000 t/a[2]。由于其广泛使用，1,2,4-TCB 已在土壤[3]、地下水[4]、废水[5-6]、活性
污泥[7]、沉积物[8]以及蔬菜[9]中检出。由于其持久性、高毒性以及随食物链富集[10]，美国环境保护局（EPA）已将其列入31种环境优先控制污染物名单[11]。
1,2,4-TCB是三氯苯中用量最大的同分异构体，并且其苯环上的氯取代基存在邻位（ortho-）、间位（meta-）、对位（para-）3种空间结构。因此，1,2,4-TCB 作为氯苯类模式污染物，其在环境中的降解已引起广大学者的关注。高电负性的氯原子使苯环成为一个很难被氧化的疏电子环[12]，1,2,4-TCB的光学和化学降解都很缓慢，生物降解就成为其降解的主要途径[13]。微生物在长期接触氯苯类化合物过程中能够通过自身变异或通过形成诱导酶而逐步适应外界环境，进而能够降解或转化此类化合物[12,14]。Field等[15]通过Gibbs自由能证实了在好氧和厌氧条件下1,2,4-TCB生物降解的热力学可行性。本文简要介绍了近年来微生物降解1,2,4-TCB的研究进展，以期为1,2,4-TCB污染修复提供依据。1 1,2,4-TCB生物降解的可行性
氯苯类化合物难以降解主要是因为高电负性的氯原子使其亲电反应活性下降[16]，化学性质相当稳定，并且由于1,2,4-TCB挥发作用强烈，不同学者对其降解研究得到不同结论。Freitag等[7]研究1,2,4-TCB在活性污泥中的降解时发现，只有少于0.1% 的1,2,4-TCB 矿化成CO2。Aelion等[17]报道了土壤蓄水层中1,2,4-TCB并没有显著矿化，经8个月的培养，矿化率不足0.3%。Brunsbach等[18]报道了在土壤泥浆中，经1个月的培养，土著微生物不能降解初始浓度为 1 mmol/L的1,2,4-TCB。Dermietzel等[19]认为在好氧条件下，从污染水体中分离得到的微生物能够在无机盐培养基中降解很少量的1,2,4- TCB。Marinucci等[20]研究了1,2,4-TCB在土壤中的降解，在20℃时，1,2,4-TCB 的矿化速率仅为1 nmol/(d·20 g土)，无机养分或共代谢不能促进其在土壤中的矿化。而Schroll等[21]研究发现在污染土壤中，经过23天的培养后，土著微生物可将62% 的14C-1,2,4-TCB矿化为14CO2。把污染土壤接种到农业土壤后亦可促进其矿化。国内，何耀武等[22]研究了在好氧和厌氧条件下1,2,4-TCB在土壤中的降解。研究表明，1,2,4-TCB在土壤中的降解符合一级反应动力学，并且好氧降解比厌氧降解迅速，降解半衰
韩国四季歌①基金项目：国家自然科学基金项目（41030531，20707028，40921061，40771104）和江苏省自然科学基金项目（BK2010608）资助。* 通讯作者（jiangxin@issas.ac）
作者简介：宋洋（1986—），男，山东济南人，博士研究生，主要从事土壤化学与污染控制技术研究。E-mail：ysong@issas.ac
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期分别为1.89 ~ 5.86天和5.07 ~ 19.08天；在100 μg/g 浓度范围内，降解速率随着1,2,4-TCB浓度的升高而加快。由此可见，尽管有研究表明其矿化速率很低，但近年来的研究亦表明了其生物降解的可行性。
2 1,2,4-TCB的好氧降解
对于1,2,4-TCB不能或只有少量被矿化的研究结果，其部分原因是由于微生物适应期不足或者降解能力不够造成的[21]。事实上，近十几年来，环境学者从活性污泥、污染土壤或水体中已经驯化、分离得到1,2,4-TCB的高效降解菌株，并通过16S rRNA技术对其进行了鉴定（表1）。
表1 已分离出的1,2,4-TCB好氧降解菌株
Table 1 Isolated strains of aerobic degradation of 1, 2, 4-TCB
降解菌分离介质时间参考文献
Pseudomonas sp.P51 底泥 1987 [23]
Pseudomonas sp.Ps1活性污泥 1993 [24] Pseudomonas stutzeri sp.THSH-1 污染土壤 2005 [25-26]
Pseudomonas nitroreducens sp.J5-1污染土壤 2005 [27] 假单胞菌
Pseudomonas sp.SA-6 污染土壤 2007 [10]
伯克霍尔德氏菌Burkholderia sp. PS14 污染土壤 1999 [1,28-29] 红球菌Rhodococcus sp.MS11 富集液 1999 [30] 博德特氏菌Bordetella sp.E3；F2 污染土壤 2007 [31-32] 肠杆菌Enterobacter sp.SA-2 污染土壤 2007 [10] 白腐真菌Trametes versicolor 2009 [33]
2.1 细菌降解1,2,4-TCB
Van Der Meer 等[23]从莱茵河底泥中分离出一株能
够降解1,2,4-TCB和所有二氯苯（DCB）的菌株，并
根据其生理特征命名为Pseudomonas sp. P51。在土柱
实验中，将P51接种到未灭菌的土柱中，并以含10 ~ 1 000 μg/L氯苯的莱茵河水淋洗，结果表明只要有氯苯
存在下P51至少能在土柱中存活60天而不失降解活性，并且在距土柱上端10 cm处对1,2,4-TCB的去除
率为2.2 nmol/(d·cm)。
Sander 等[28]从一个废弃物处理厂的土壤中分离
得到两株氯苯降解菌，并根据其生理特征鉴定为假单
胞菌Pseudomonas sp. PS12 和Pseudomonas sp. PS14，其中 PS12 能够利用一氯苯（MCB）、所有 DCB 和1,2,4-TCB为碳源生长；PS14 还能降解 1,2,4,5-四氯苯（1,2,4,5-TeCB）。Rapp 等[1,29]
通过 16S rRNA 技术，
将Pseudomonas sp. PS14 重新鉴定为伯克霍尔德菌Burkholderia sp. PS14，它能将初始浓度为 500 nmol/L 的 1,2,4-TCB 在 1 h 内降解到检测线以下（0.5 nmol/L），矿化率达到 63%。在含1,2,4-TCB 54.4 ng/g 的灭菌土
壤中接种 PS14，经 72 h 后矿化率可达 80%。Rapp
等[30]又从Burkholderia sp. PS14 的富集液中分离得到
一株 1,2,4-TCB 降解菌，并鉴定为红球菌Rhodococcus sp. MS11。MS11 不仅能够降解 1,2,4-TCB，还能降解1,2,4-三溴苯，1,2-、1,4-二碘苯，也能利用1,4-二氟苯生长，表现出较宽的降解谱。
Adebusoye 等[10]报道了从热带土壤中分离得到的两株多氯联苯降解菌并鉴定为肠杆菌Enterobacter sp. SA-2 和假单胞菌Pseudomonas sp. SA-6，它们能够以1,2,4-TCB 为唯一碳源和能源生长，并可降解所有DCB 和其他 TCB，不能以 TeCB 为唯一碳源生长。这是首次报道的从热带土壤中分离的氯苯降解菌。
国内对1,2,4-TCB的研究并不多，但也分离出高效降解菌株。如从氯苯生产车间的土壤中分离的施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri sp.THSH-1和硝基还原假单胞菌Pseudomonas nitroreducens sp. J5-
1[25-27]。在THSH-1中发现一大小40.2 kb的质粒，将其转化到E.coli.JM109中，转化子能够以1,2,4-TCB为唯一碳源生长，且有氯离子释放。J5-1对1,2,4-TCB降解服从一级反应动力学，当底物浓度由4 mg/L上升到400 mg/L 时，其降解速率常数逐渐增大，降解半衰期逐渐缩短。王芳等[31-32]采用同位素示踪法从受氯苯污染长达25年的土壤中分离得到能够矿化1,2,4-TCB的菌株E3和F2，并鉴定为博德特氏菌Bordetella sp.。E3和F2能够将1,2,4-TCB彻底降解成14CO2，30天内降解率达到90% 以上，把F2接种到土壤30天后，有39% 的1,2,4-TCB 矿化成14CO2，而未接种处理矿化率仅有2%。
第3期宋 洋等：微生物降解1,2,4-三氯苯研究进展 345
Asconcabrera等[24]利用硅油和无机盐组成的双液相体系，经1个月的驯化，成功分离了一株1,2,4-TCB 降解菌，并根据生理特征鉴定为假单胞菌Pseudomonas sp.Ps1，研究发现有50%的微生物集中在双液相界面层中利用底物生长，这种双液相体系显著缩短了分离菌株所需要的驯化时间。
2.2 真菌降解1,2,4-TCB
对1,2,4-TCB的降解并不只限于细菌。Marco-Urrea 等[33]首次报道了白腐真菌Trametes versicolor对氯苯类化合物的降解。当1,2,4-TCB浓度为6 mg/L时，培养4天时降解速率为2.49 nmol/(d·mg) 细胞干重，7天后降解率达79.6%，培养基中氯离子与1,2,4-TCB浓度比为2.6:1，表现出较强脱氯能力。
2.3 1,2,4-TCB好氧降解途径
好氧条件下，1,2,4-TCB 的降解途径分为先脱氯再开环和先开环再脱氯两种方式。
Marinucci 等[20]研究了1,2,4-TCB 在富集液中的降解，通过对中间产物的测定推导出其可能的降解途径是先脱氯再开环，即首先在单加氧酶的作用下脱除一个氯原子形成二氯代苯酚。Marinucci等[20]指出，由于对位氯取代基的吸电子效应，使相应的碳离子比较稳定，反应活性降低，因此，首先脱除的应该是1、2位的氯原子。产物中有大量的 2,4-二氯酚存在，而2,5-二氯酚和2,6-二氯酚相对较少也证实了此观点。2,4-二氯酚再在单加氧酶作用下形成3,5-邻苯二酚，然后在邻苯二酚双加氧酶的作用下开环氧化。
多数分离的菌株对1,2,4-TCB的降解都是通过先开环后脱氯途径[26,28,33-36]。如图1所示，1,2,4-TCB在双加氧酶的作用下产生环双氧化，在苯环上插入氧原子形成环状氯代二醇，再在脱氢酶的作用下，脱去两个氢原子转化为3,4,6-三氯邻苯二酚；邻苯二酚在邻苯二酚1,2双加氧酶(Ⅱ)的作用下氧化开环，生成氯代粘康酸（2,3,5-三氯-2,4-己二烯二酸），它能在环异构酶Ⅱ的作用下产生内酯化脱去氯原子生成2,5-二氯-2,4-二烯-1,4-内酯-己酸，进而通过水解酶Ⅱ生成2,5-二氯-4-氧代-2-烯己二酸，这种化合物可在NADH作用下打开双键，形成饱和脂肪酸，同时脱去氯离子，进而断裂形成琥珀酸和乙酸，最终进入TCA循环。Marco-Urrea等[33]在研究真菌对1,2,4-TCB的降解时指出，细胞素P450单加氧酶参与了1,2,4-TCB第一步氧化，即1个氧原子插入到5,6位C=C双键中，然后再在环氧化物水解酶作用下生成环状氯代二醇，后续降解途径与上述相似，略有不同的是在2,5-二氯-2,4-二烯-1,4-内酯-己酸水
解时释放一个氯离子产生5-氯-4-氧代-2-烯己二酸，进而生成5-氯-5-羟基-4-氧代-2-烯戊酸。
图1 1,2,4-TCB好氧降解途径[26,28,33-36] Fig. 1 Pathway of aerobic degradation of 1, 2, 4-TCB
2.4 1,2,4-TCB的降解基因
1,2,4-TCB的降解是由多个降解基因和酶共同作用实现的。van der Meer等[34-36]通过杂交的方法研究P51对1,2,4-TCB的降解，在一大小110 kb的降解质粒中检测到两个基因簇，并在 E.coli，A.eutrop
hus和P.putida中克隆了该降解基因，结果表明两个基因簇分别编码1,2,4-TCB上游和下游的降解途径（图1）。其中tcbA和tcbB负责编码1,2,4-TCB上游降解，即将
346 土壤第43卷
1,2,4-TCB在双加氧酶系统和脱氢酶作用下转化成氯代邻苯二酚；tcbC、tcbD和tcbE负责下游降解，分别编码邻苯二酚1,2双加氧酶(Ⅱ)（CC12O）、环异构酶Ⅱ和水解酶Ⅱ。Rapp等[30]采用PCR方法检测到MS11含有编码氯苯双氧化酶的基因。宋蕾等[27]从J5-1基因组DNA中克隆得到了CC12O基因并命名为tcbC。根据11个CC12O基因的进化树分析得出tcbC与来自Pseudomonas sp. P51的tcbC同源性最高。
3 1,2,4-TCB的还原脱氯
卤代有机化合物在厌氧微生物代谢过程中可以起到3种作用：①作为碳源或能源或二者都是；②作为共代谢基质；③作为最终电子受体[37]。研究表明，厌氧条件下，微生物可以通过脱氯共呼吸作用，将氯苯类化合物还原脱氯[38]。在此过程中，氯苯类化合物作为最终电子受体，微生物在转移电子的同时合成自身生长所需要的能量（ATP）。其中，葡萄糖、甲醇、乙醇、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乳酸和氢等均能作为良好的电子供体（表2）。从Gibbs自由能△G0’角度，1,2,4-TCB发生还原脱氯反应的产物顺序应该是1,4-DCB＞1,3-DCB＞1,2-DCB，即1，2位的氯离子最容易脱掉[47]。但也有研究
报道，在对海洋沉积物的厌氧培养中，1,2-DCB生成速率最快，2位和4位的氯离子释放速率比1位快10倍[39]。
Ramanand等[40]报道了产甲烷条件下，接种可以降解1,2,4-TCB的微生物菌于土壤泥浆中，30天内可以将初始浓度1 500 μmol/L的1,2,4-TCB降解63%，142天时残留浓度为8.7 μmol/L，脱氯产物主要是1,4-DCB和少量的1,3-DCB。Middeldorp等[42]报道了产甲烷菌在4天内能够将大于20 μmol/L的1,2,4-TCB完全降解为1,4-DCB 进而继续脱氯生成MCB，乳酸盐、葡萄糖、乙醇、甲醇、丙酸盐、乙酸盐、氢气均能作为脱氯过程中的电子供体，但甲酸盐不能。很多学者在研究六氯苯还原脱氯时表明1,2,4-TCB 作为六氯苯还原脱氯的中间产物，还可以继续厌氧脱氯[41-48]。
Adrian等[43]通过39次连续转接，从流化床生物反应器中分离得到能够还原脱氯的厌氧混合菌，在以丙酮酸盐为碳源和能源，以Ti(Ⅲ) 为还原剂的培养基中，菌可以在14天内将20 μmol/L的1,2,4-TCB完全脱氯降解，高浓度的硫酸盐显著抑制脱氯反应，但当硫酸盐还原完全后，1,2,4-TCB脱氯重新开始。反应过程中甲酸盐作为直接电子供体提供电子给三氯苯，而氢气不能作为电子供体。Adrian等[44]对上述菌进行了进一步的转接，在10 mmol/L丁酸盐和柠檬酸钛共存的培养基中，经7 ~ 9天培养，可将15 μmol/L的1,2,4-TCB完全转化成1,4-和1,3-DCB。菌的生长受1,2,4-TCB浓度的限制，脱氯能力与三氯苯浓度线性相关。与前期研究结果不同的是转接后的菌还可以利用氢气作为电子供体。
表2 厌氧微生物对1,2,4-TCB的还原脱氯降解
Table 2 Reductive dechlorination of 1, 2, 4-TCB by anaerobic microcosms and strains
菌体来源电子供体脱氯产物参考文献海洋沉积物1,2-DCB, 1,4-DCB, 1,3-DCB [39] 泥浆富集液1,4-DCB, 1,3-DCB, MCB [40]
活性污泥1,2-DCB, 1,3-DCB, 1,4-DCB [41] 河流沉积物+活性污泥乳酸盐、葡萄糖、乙醇、甲醇、丙酸
盐、乙酸盐、氢气
1,4-DCB, MCB [42]
流化床生物反应器丙酮酸盐或甲酸盐1,4-DCB, 1,3-DCB [43] 流化床生物反应器丙酮酸盐或氢气1,4-DCB, 1,3-DCB [44] Dehalococcoides sp.CBDB1氢气1,4-DCB, 1,3-DCB [45] Staphylococcus epidermidis Strain A 氢气 NADPH 1,2-DCB, 1,4-DCB, 1,3-DCB, MCB [46]
1,2,4-TCB的厌氧降解多数情况是混合菌作用结果，纯菌株的分离一直是难点所在，而只有分离出纯菌株才能明晰1,2,4-TCB 的还原脱氯过程。2000年Adrian等[45]第一次分离出能够在严格厌氧环境下降解氯苯类化合物的菌株Dehalococcoides sp.CBDB1，它能在氢气共存条件下将1,2,3-TCB、1,2,4-
TCB、1,2,3,4-TeCB、1,2,3,5-TeCB和1,2,4,5-TeCB还原脱氯，并能通过“脱氯共呼吸”作用满足其对能量的需求。
舌尖上的宿舍
第3期宋 洋等：微生物降解1,2,4-三氯苯研究进展 347
菌株14 ~ 21天内能将1,2,4-TCB降解成72% 的1,4-DCB 和28% 的1,3-DCB，但它对氧气极为敏感，在好氧条件下暴露几秒钟即失去脱氯能力。Dehalococcoides sp. CBDB1的细胞提取物还能降解五氯苯和六氯苯[49]，但通过破碎细胞并没有提高三氯苯的降解速率，作者推断其还原降解三氯苯的酶可能来自细胞膜外。
4 共代谢
Jensen[50]将共代谢的概念定义为只有在初级能源物质存在时才能进行的化合物的生物降解过程。微生物对非生长机制的降解无论是氧化作用还是还原作用都是共代谢。迄今为止对1,2,4-TCB共代谢降解报道不多。Brunsbach等[18]报道了在土壤泥浆中，接种能够降解MCB和1,4-DCB的菌株Pseudomonas aeruginosa strain RHO1，在10 mmol/L乙醇或乙酸盐共存下，RHO1能够降解0.5 mmol/L浓度的1,2,4-TCB并释放出1.47 mmol/L的氯离子。并且当初级生长物质降解完全后，1,2,4-TCB的降解也停止。1,2,4-TCB的存在使得该菌对MCB和1,4-DCB的降解产生滞后，降低其降解速率，说明两种基质的代谢之间存在着相互作用[12]。共代谢还存在另外一种机制，即生长基质被完全
消耗时处于内源呼吸状态的微生物对非生长基质的转化[50]。瞿福平等[46]研究发现，当分别用CB、1,2-DCB 和1,3-DCB驯化污泥30天后，处于内源呼吸状态的微生物不能降解1,2,4-TCB，而1,4-DCB驯化的污泥能够降解1,2,4-TCB。这是因为1,4-DCB与1,2,4-TCB结构上存在相似的“连续两空结构”，与CB等存在的“连续三空结构”不同，所以诱导的酶对底物要求不同，降解能力也就不同[46]。
Adrian等[47]认为，在厌氧条件下如果脱氯反应对微生物生长没有影响，那么这一过程也属于共代谢过程。如从老鼠肠内分离得到的兼性厌氧菌表皮葡萄糖球菌Staphylococcus epidermidis strain A 能够在氢气共存的厌氧条件下将1,2,4-TCB还原脱氯，但DCB的生成速率只有6.8 nmol /(mg (细胞干重)·d)[51]。脱氯过程与细菌生长关系不大，并且好氧条件下菌株生长更旺盛。这是唯一在厌氧条件下共代谢降解1,2,4-TCB的菌株。zhengzhoudaxue
5 展望
随着六氯苯、五氯苯先后被列为持久性有机污染物，人们对环境中氯苯类化合物的消除将更为关注。在实验室可控条件下已经分离得到多株1,2,4-TCB降解菌，但对其在自然环境下的修复潜力研究较少。自然环境在污染物浓度、环境温度、pH等方面与实验室条件截然不同，如何完成特定微生物在自然环境中的定殖行为而不失其降解活性以及基因工程菌的构建，是今后亟待解决的问题。随着厌氧菌株在特定培养基上分离成功，厌氧微生物对1,2,4-TCB等氯苯类化合物的还原脱氯降解机制将更为清
晰，能否分离出更多厌氧降解菌；在多大程度上能刺激或加速厌氧微生物在沉积物以及地下水等环境中对氯苯类化合物的生物修复将得到更广泛的关注。
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站长QQ:729038198
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