原核表达质粒pBBR1-MCS-EGFP的构建1

原核表达重组质粒pBBR1-MCS-EGFP的构建

(实验方案)

1、实验材料

质粒和菌株：真核表达质粒pEGFP-N1，原核表达质粒pBBR1-MCS，宿主菌E.coil S17-1。

主要试剂：限制性内切酶BamH I、Kpn I；T4 DNA连接酶；DNA Marker（2000,10000）；DNA胶回收试剂盒；质粒小提试剂盒；DNA纯化试剂盒；PCR用试剂；链霉素（E.coil S17-1抗性）；卡那霉素（pEGFP-N1抗性）；LB培养基等。

二、实验步骤

1、pEGFP-N1质粒的提取

（1）含pEGFP-N1的重组菌（pEGFP-N1/DH5α）的复苏

将冻存的重组菌接种LB培养液，37℃，160rpm振荡培养过夜。用接种环挑取少许菌液划线

接种LB+Km平板上（100mL LB培养基高压冷却至不烫脸，加入50mg/mL的卡那霉素储存液100μL ），37℃培养24小时观察细菌生长状况，然后再进行传代。

（2）挑取单个菌落接种LB+Km液体培养基，37℃振荡培养过夜。用质粒提取试剂盒提取pEGFP-N1质粒，0.8%琼脂糖电泳（10kb Marker）检测提取效果。

2、引物设计与合成

根据EGFP基因序列并参考pEGFP-N1载体序列和pBBR1-MCS多克隆位点信息，设计一对特异性引物F1、R1，用来克隆EGFP基因编码区，如下所示：

F1：5，-CGGGGTACCGATGGTGAGCAAGGGCGAG-3，

（Kpn I酶切位点序列及其保护性碱基）

R1：5，-CGCGGATCCATTCTTGTACAGCTCGTCCAT-3，

（BamH I酶切位点序列及保护性碱基）

引物送由生物公司合成

3、目的基因EGFP的PCR扩增与产物回收

以含EGFP基因的质粒为模板，用特异性引物F1、R1扩增EGFP基因。25μL PCR扩增反应体系：12.5μL 2×Taq PCR MasterMix；2μL模板（质粒）；20μmol/L上下游引物各0.5μL；9.5μLddH2O。扩增反应条件为：95℃5min；94℃30s，63℃30s，72℃30s,35个循环；72℃10min；4℃终止反应。（条件需摸索）。取5μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照。

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收EGFP目的基因。

4、大肠杆菌S17-1感受态细胞的制备

(1)将摇菌过夜的种子液3mL加入到100mL LB（无NaCL）液体培养基中转摇4.5h。

(2)冰浴40min。

(3)分装到2个50mL 离心管，12000r/min，离心10min。

(4)分别用 0.1mol/L 职业化意识CaCl2 10mL香茅醇重悬，12000r/min，离心10min伊斯兰之声。

(5)重复步骤（4）3次。

(6)分别加入 0.2mol/L CaCl2 300μL，50%甘油 300μL 混匀。

(7)每管100μL 分装EP管中，-80℃保存。

5、目的基因EGFP和pBBR1-MCS表达载体的双酶切

双酶切体系为：

EGFP的回收产物或pBBR1-MCS 10μL

10×Buffer K 5μL

Kpn I 1.5μL

BamH I 1μL

ddH2O 82.5μL

合计 100μL

37℃水浴office20026h，经1%琼脂糖凝胶电泳检测（单一条带，应分别与目的基因EGFP和pBBR1-MCS 质粒片段大小差不多）后，DNA纯化试剂盒纯化回收酶切产物，电泳检测回收效果。

6、原核表达重组质粒pBBR1-MCS-EGFP的构建

（1）将上述回收纯化的EGFP和pBBR1-MCS质粒利用T4 DNA连接酶连接。

20μL酶连体系：10×T4 Buffer 2μL

T4 连接酶 0.5μL

EGFP片段 10降膜吸收塔μL

pBBR1-MCS质粒片段 5μL

ddH2O 2.5μL

点动混匀16℃连接过夜。

（2）连接产物转化大肠杆菌S17-1感受态细胞

（10μL加入100μL感受态细胞中（加两管，第三管不加作空白对照），冰中放置30min;42℃水浴45s,再在冰中放1min.向三管均加入890μLLB液体培养基，37℃振荡培养60min,混匀；将1、2管各涂布于一块LB+SM+KM平板上。第三管平均涂布LB和LB+SM+KM平板上。培养过夜鉴定，空白的LB+SM+KM应不长菌，其余3块均长菌。），37℃振荡培养1h，均匀涂布LB+Sm（50ug/mL）+pBBR1-MCS载体抗性（待定）平板，37℃过夜培养。

7、重组表达质粒的鉴定

（1）荧光鉴定：将过夜培养的平板至4℃冰箱1-2天后，在自然光下即可肉眼观察到绿菌落并拍照。

挑取转化平板上的单个菌落，接入LB+Sm（50ug/mL）+pBBR1-MCS载体抗性（待定）液体管，37℃摇菌过夜。取2μL菌液滴在载玻片并盖好盖玻片后，置于荧光显微镜下观察菌

液的产荧光情况并拍照。

（2）质粒PCR鉴定：以质粒pBBR1-MCS-EGFP为模板，利用EGFP特异性引物进行PCR扩增。

25μL PCR扩增反应体系：依次添加9.5μLddH2O；20μmol/L上下游引物各0.5μL；2μL模板（质粒）；12.5μL 2×Taq PCR MasterMix。扩增反应条件为：95℃5min；94℃30s，63℃30s，72℃30s,35个循环；72℃10min；4℃终止反应。（条件需摸索）。取5μL PCR产物，用1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统拍照。

（3）双酶切鉴定：