真核表达载体 pcDN A3．1（＋）-G FP-M C1R 的构建及在羊驼毛囊干细胞中的表达 东欧计划
白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海追溯调整
【摘 要】旨在构建含有 MC1R基因的pcDNA3．1（＋）真核重组表达载体，为进一步研究 MC1R的生物学功能奠定基础。应用RT‐PCR技术从羊驼皮肤cDNA文库中扩增 MC1R基因全长cDNA ，然后通过双酶切将 MC1R基因全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3．1（＋），然后采用脂质体法转染体外培养的羊驼毛囊干细胞后，通过G418筛选培养，建立稳定的转染体系，直接荧光观察pcDNA3．1／MC1R融合蛋白在细胞中的分布定位，并通过Western Blot方法检测 MC1R在羊驼毛囊干细胞中的表达。结果表明，成功构建了pcDNA3．1／MC1R重组表达载体，并且发现试验组的毛囊干细胞中表达 MC1R蛋白显著高于空白组（P＜0．05）。成功构建了含有绿荧光蛋白基因的真核表达载体pcDNA3．1／MC1R ，且 MC1R基因在羊驼毛囊干细胞中获得表达。%It is the base of further study on MC1R biological functions to construct the pcD‐NA3 .1 eukaryotic expression vector of MC1R gene in alpaca .MC1R gene was amplified by RT‐PCR with the cDNA from alpaca skin library .PCR products and pcDNA3 .1 plasmid were digested and recycled by BamHI and E coRI endonuclease .The positive clones were selected , from which plasmid DNA was abstracted and identified by restriction endonuclease ,sequence identification and sequencing . The pcDNA3 .1/MC1R recombinant expression plasmid was transfected into alpaca hair follicle stem cells by Lipofectamine TM 2000 .After screening culture by G418 ,a stably‐transfected cell system was established .Fluorescent microscopy was em‐ployed to reveal the localization of MC1R in alpaca hair follicle stem cells ,and the transcrip‐tion and expression of the MC1R were identified by Western Blot .The results show that eu‐karyotic expression vector pcDNA3 .1/MC1R was successfully constructed .When pcDNA3 . 1/MC1R recombinant expression plasmids were transfected into alpaca hair follicle stem cells , the expression of MC1R was up‐regulated (P<0 .05) .This study successfully constructed eu‐karyotic expression vector containing green fluorescent protein gene pcDNA 3 .1/MC1R .It could up‐regulate the expression of MC1R in alpaca hair follicle stem cells .
【期刊名称】《河北农业大学学报》
【年(卷),期】2015(000)003
【总页数】5页(P86-90)
【关键词】羊驼;黑素皮质激素受体1;毛囊干细胞;真核表达载体;转染
【作 者】白瑞;王振华;尹志红;弓慧敏;于志慧;庞全海
【作者单位】山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801; 山西医科大学 晋祠学院，山西 太原 030025;山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801;山西农业大学动物科技学院，山西 太谷 030801
【正文语种】中 文
【中图分类】Q78
22种天然毛是羊驼的非常重要的经济性状之一［1］。在哺乳动物中，毛主要与毛囊中的黑素细胞的数量以及动物体内的合成以及分泌等方面有着非常重要的关系［2－3］，而素合成的数量及分布主要受控于黑素皮质素受体 1（MC1R）［4］。MC1R
在黑素细胞、神经细胞等多种细胞上发挥作用。MC1R与其配体α－MSH和ACTH结合后，一方面通过黑素细胞内cAMP第二信使参与上调酪氨酸酶的表达量，TYR可以对于黑素细胞之中的酪氨酸起到催化作用，使其生成多巴，而在黑素体内聚集一定数量的多巴之后，会进行黑素的释放，同时还具有促进黑素细胞增殖的作用，所以MC1R是cAMP信号通路中调节真黑素形成的关键受体［5］，而且MC1R属于agouti基因在伪黑素合成时的必须物质，而这个时候Agouti属于旁分泌的一种信号因子，是由真皮乳头细胞分泌的，而Agouti还能够与ACTH和α－MSH竞争性的结合，从而使黑素合成途径被切断，激活并合成一定的伪黑素［6］。
在哺乳动物之中，毛属于质量性状，受到多基因的控制［5］。根据现有的研究成果，可以设想哺乳动物毛基因的调控，MC1R基因对于哺乳动物的毛起到决定性的作用［7］。试验选择该目的基因具有重要的生物学意义，本试验运用基因工程技术，对MC1R基因进行克隆、酶切等构建了其真核表达质粒pcDNA3.1（＋）－GFP－MC1R，通过PCR、双酶切和测序来鉴定质粒pcDNA3.1（＋）－GFP－MC1R构建成功，并转染羊驼毛囊干细胞中，为深入研究MC1R的生物学功能奠定试验基础，也为以后通过转基因技术来改造动物毛提供理论依据。
1 材料与方法
北京的彩1.1 材料
液体树脂羊驼皮肤组织材料等取自山西农业大学羊驼养殖基地；羊驼皮肤cDNA文库、带有绿荧光蛋白基因载体pcDNA3.1（＋）－GFP由羊驼生物工程实验室保存，质粒pcDNA3.1（＋）载体购自上海生物化学研究有限公司，大肠杆菌DH5α由本实验室保存；限制性内切酶BamHI、EcoRI聚合酶、T4DNA连接酶以及PCR反应试剂、胶回收试剂盒、DNA Marker DL 5000等购自大连宝生物工程有限公司；脂质体LipofectamineTM2000转染试剂购自Invitrogen公司；转染稀释液（Opti－MEM I）购自 Gibco公司；引物由大连宝生物工程有限公司合成；KSFM及DMEM／F12培养基、PBS、胰蛋白酶均购置Gibco公司。
1.2 方法
1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank公布的羊驼 MC1R序列 （No.EU135880）和pcDNA3.1（＋）质粒上的多克隆酶切位点由Oligo软件设计引物。在上下游引物P1、P2中分别设置BamHI、EcoRI酶切位点，设计引物如下：P1：5＇－AGAGGATCCCCTTTCCT
GCTCCCTG－3＇，P2：5＇－CTC－GAATTCATTGCCAAG－TAACTGCCC－3＇，引物由大连宝生物工程有限公司合成，加黑下划线分别为BamHI，EcoRI酶切位点序列。
1.2.2 MC1R全长cDNA的获取 以实验室保存的羊驼皮肤cDNA文库为模板，采用PCR方法扩增羊驼MC1R全长cDNA，全长编码区为1 081bp，反应程序为95℃5min；94℃1min，62℃1min，72℃1min，35个循环；72℃ 延伸10min。PCR产物经10g／L琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，经纯化回收PCR产物并送至大连宝生物工程技术有限公司测序。
1.2.3 羊驼MC1R重组真核表达载体的构建和鉴定 pcDNA3.1（＋）质粒和MC1R基因分别用限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切，并纯化回收目的片段，用T4DNA连接酶于16℃连接6h，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，用含卡那霉素（100mg／L）的LB培养基筛选，37℃培养12h，挑选阳性克隆进行酶切，并进行PCR鉴定，阳性克隆的质粒DNA由大连宝生物工程有限公司进行序列分析鉴定。
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1.2.4 羊驼毛囊干细胞培养 取羊驼背部皮肤标本1.0cm×0.2cm，置入预冷的培养基带回实验室，在生物安全柜中置于75%酒精中漂洗2次，每次1min，然后再通过D－PBS冲洗3～5次，每次3min，用眼科剪修剪处理好的皮肤，置于0.25%的DispaseⅡ酶中，37℃消化2h，
用眼科镊将毛囊拔出置于试管中，添加0.25mg／mL胰酶＋0.2mg／mL的EDTA（1∶1），37℃消化2h，用新生牛血清终止消化，离心并收集细胞，用毛囊干细胞培养基（实验室自配）重悬细胞，接种于培养板上，每3d换液1次，观察细胞生长状况。置37℃，5%CO2培养箱中培养，待毛囊干细胞铺满80%时，加入0.25%胰酶消化，按1∶2传代。
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1.2.5 重组质粒转染羊驼毛囊干细胞 取第3代羊驼毛囊干细胞按照1×105个／mL密度接种到24孔板，细胞生长到汇合率达70%～80%时，用Opti－MEM I分别稀释0.8μg重组质粒 pcDNA3.1／MC1R－EGFP和2μL LipofectamineTM2000，并置于无血清的DMEM培养基中，37℃，5%CO2环境内培养.转染后12h更换含血清的完全培养基，48h之后使用800μg／mL的G418进筛选，3周后对G418抗性的细胞克隆进行收集并且进行扩增培养（pcDNA3.1／MC1R－EGFP转染组），相同的方法将空质粒pcDNA3.1转染入羊驼毛囊干细胞中。
1.2.6 Western－blot检测 MC1R的蛋白水平表达
收集转染的羊驼毛囊干细胞，裂解后提取50 μL总蛋白，然后SDS－PAGE电泳转移到NC膜。NC膜经过5%脱脂奶粉封闭液室温封闭2h，并且将转印膜置于杂交袋中，加入兔抗MC
1R多克隆抗体（TBST 1∶200稀释），封口，37℃孵育1h，然后4℃孵育12h，TBST洗膜3次，每次5min，将膜放入自封袋中，加入 HRP山羊抗兔IgG（TBST 1∶1 000稀释），室温反应1h，将转印膜取出，TBST漂洗3次，每次5min，室温条件下DAB显5min，在出现了棕黄条带后，终止显（内参抗体为兔抗β－actin多克隆抗体，按1∶200稀释）。
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