全宋文
在排除了其他问题后，我做了摩尔⽐的调整，需要做OD260的测量。不要怕浪费回收的载体和⽚段因为实际⽤量⾮常少，看了下⾯我们的实验实例就知道了。 摩尔⽐是指载体和插⼊⽚段，在连接时的摩尔⽐。
1 ⽐例应该在1:2-6之间（载体：⽚段；⽚段要多）。
2 连接体系如果是20微升，载体和⽚段的总质量（微克）要在0.02微克~0.2微克之间。如果是10微升，则在0.01~0.1微克之间。我⼀般都⽤到接近上限。 3 EDTA不能太多。否则可能影响连接酶。
附加：
如何计算摩尔数和微克数（⽤20微升的链接体系，NEB的T4 DNA ligase）
公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数
实例：⽚段⼤⼩=555bp=0.555kb，浓度=0.19微克/微升srs
载体⼤⼩=4.969kb，浓度=0.115微克/微升
选取：载体0.04pmol；⽚段0.12pmol（载体：⽚段=1:3）
代⼊公式：pmol数*kb数（双链）*0.65=微克数；
载体⽤0.129微克（1.12微升）；⽚段⽤0.043微克（0.23微升）：：：注意20微升体系
得出：载体和⽚段的总质量=0.043+0.129=0.172微克（在20微升体系所要求的0.02~0.2微克之间）
连接体系：体积按需调整，我们喜欢⽤20ul的体系。你如果要⽤10ul的，把上述⽤量减半。
20ul体系：
3d⽔15.65 ul，
⽚段0.23 ul，
载体 1.12 ul，
将上⾯三个液体混匀，45摄⽒度⽔浴5min，迅速插⼊冰中，2min
广东移动万花筒
hcap
保持在冰浴中，加⼊
10×buffer 2 ul建行网点转型
T4 DNA ligase 1 ul
混匀，4℃连接过夜
另外⼀种推算结果
设x1为DNA⽚段pmol数，x2为其ug数；设y1为载体pmol数，y2为载体ug数，a为DNA⽚段的kb数，b为载体的kb数，并且假定摩尔⽐为DNA⽚段：载体=3:1，则有
x1·a·0.65=x2
y1·b·0.65=y2
x1：y1=3
x2+y2=0.2（总质量）
最后提⽰：
不要怕测OD260浪费了回收的载体和⽚段，因为实际上⽤的很少（见上述）。不要嫌测OD 值⿇烦，因为⾮常必要，尤其是连接效率不⾼的质粒和⽚段。
雄足球论坛根据酶切电泳条带估计⽤量通常都不能得到最⼤的连接效率，对初学者来说，估计通常不准。我有⼀次，按照估计的，两个板⼦才有⼀个克隆；按照摩尔⽐1:3连接得到了⼤约150个克隆；按照摩尔⽐1:10只得到了平均15个克隆/板。这说明：⽚段过多，过犹不及。
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