CRISPRCas9基因敲入试验步骤(三)donor载体构建载体构建 CRISPR/Cas9质粒按编辑细胞类型可分为八种，Mammalian 、Bacteria 、Drosophila 、Plant、C。 elegans 、Yeast 、Zebrafish 、Xenopus，根据质粒所携带的编辑基因的不同，可分为野生型的cas9、突变型的cas9、cpf1、C2c2(可剪切RNA）.当然，还有一些筛选标记,如puro、GFP、RFP、mcherry、潮霉素等等，我们可以根据自己的需求选择自己合适的质粒.这里故意还掉了一种，最具有争议的Ngago，本楼主也重复过这个试验，也和大多数重复的人一样,GFP验证试验时，看到荧光显著减弱（本人还特意构建了一种Ngago载体,效果比韩老师的效果好很多），但是当时没有验证这个减弱是切割还是敲低，非常遗憾自己想法太简单,以先入为主认为是切割而没有去验证;最终结果是刘东老师使用Ngago发现了有表型（斑马鱼的眼睛上有缺陷）,这个就是很强的提示，需要去做下一步，尽管基因组上没有被切割，有表型，那势必会去看该基因表达的数据,最后才有这篇文章。刘东老师运气也很好，knock down 有表型，如果没表型，估计也会放弃。这里就说到这，有不懂的可以留言询问。。具体分类在addgene上有,网址www。/crispr/。
2、酶切位点的选择
结合律>北京中新企业管理学院插入sgRNA的酶切位点，质粒基本为这两种，BsmbI和Bbsi,具体可以参见该质粒的protocol，后续的连接、转化、验证protocol里面有,我就不啰嗦了。哦还忘了一件事,使用snapgene这个软件可以很好地看质粒图谱，非常方便，强烈推荐!！以慢病毒载体V2为例具体说明3、同源臂的设计
防辐射屏
同源臂我们一般都是在切割位点的两端各选一段,长度大约1kb—2kb，效率还可以.当然了，有人也用40—100bp做了也做成功了，但基本原则是越长效率越高.1kb—2kb效率已经很高,所以这个最合适.有相关文献支持，自己Pubmed查看.
4、启动子、目的基因及其终止子的扩增国际篮球规则
这里也没什么可说的，启动子在我们选择质粒的时候就决定了,当然我们还可以改造以提高sgRNA的表达效率,这个时候我们可以通过方法筛选出该物种的启动子,替换上去就ok了。
目的基因的话，如果我们要做敲除，基本就是根据基因组，在外显子区域设计sgRNA序列,切割后以非同源性末端接合（Non-homologous end joining， NHEJ），造成变异而使该
基因失去功能。当然还有一种修复方式,同源性重组(Homologous recombination，HR）同源性重组修复是利用细胞内的染体两两对应的特性,若其中一条染体上的DNA发生双股断裂,则另一条染体上对应的DNA序列即可当作修复的模版来回复断裂前的序列，因此在某些条件下，同源性重组又称作基因转换(gene conversion）。该方法是用于敲入基因，这个同时,我们可以加入抑制NHEJ修复的酶，同时就会促进HR修复，提高重组插入效率. 终止子的话,没什么特别，基本可以通用,SV40终止子、BGH终止子等。
5、donor载体的连接及克隆测序
donor载体的连接及克隆测序这个就是我们分子生物学学生的基本功了，就不叙述了.维果斯基的最近发展区理论
6、细胞转染及载体功能的验证
细胞转染的话，参见说明书就好了，转染试剂有lipo2000（适合siRNA和DNA共转染）、lipo3000（适合DNA）、以及罗氏、qiagen的等。当然还有国产的一些转染试剂，实验室穷点就可以买下，效果还可以，汉恒生物的,比较便宜。
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