摘要:PCR产物与克隆载体连接是基因克隆环节中重要的一步。文章介绍了一种简便、通用的质粒构建方法。此法是在PCR引物设计时,在目的片段5′端加上BsaI序列,然后通过BsaI酶切产生具有相同粘性末端的载体和插入片段,经过连接,获得重组质粒。 关键词:质粒构建 反向PCR BsaI 无缝连接
质粒构建技术是基因工程常用的技术之一,即将一段需要克隆的外源DNA片段插入到载体DNA分子中形成重组DNA分子,然后将该重组载体转运到宿主细胞中[1,2],常规质粒的构建方法是在插入片段和载体两端分别寻相同的酶切位点,即双酶切后可以产生相同的粘性末端[3,4]。本方法克服了这个局限性,通过利用BsaI鹿鼎记2攻略酶切特点实现了载体与插入片段的无缝连接。本实验以载体pKH和DNA片段CP(关于企业所得税若干优惠政策的通知一种蛋白质内含子的编码基因)为例介绍这种通用并且简便的质粒构建方法。
1 材料与方法
1.1 材料
以质粒pKH作为构建质粒的载体,pMCP含有编码CP的基因。质粒pKH(3516bp)和pMCP来自加拿大DalhousieUniversityPaulLiu教授实验室,含有氨苄青霉素抗性基因和卡那霉素抗性基因,常被用来作为分子生物学试验的载体。本实验中所选择的pKH的插入位点位于卡那霉素抗性基因中(图1)。
1.2 引物设计与合成
图2(A)展示了BsaI酶切位点,它的识别序列与切割序列不一致,它在识别序列后的第一位碱基和互补链的第五位碱基切割。在载体的插入位点处设计一对含有BsaI酶切位点的引物,对载体进行反向PCR,引物5’端加上BsaI酶切序列和保护碱基,另外还需要补充目的片段末端的四个碱基。在本实验中,对载体pKH进行反向PCR设计的引物为pKHA和pKHB(日内瓦会议图2中B),从5’3’依次是保护碱基(ATC),BsaI酶切序列(阴影部分),插入片段CP端的四个碱基(小写部分),以及与载体互补序列工艺设计(划线部分)山东建筑大学 高鹏。对插入片段扩增的一对引物包括保护碱基,BsaI酶切序列以及与插入片段互补的序列。如图2(C)所示,本实验用于PCR扩增CP的引物CPb1和CPb2包括了保护碱基(ATC),BsaI酶切序列(阴影部分),地球物理学进展插入片段互补序列(划线部分)。
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