Li Zhenling;Wang Di;Song Yuanjian;Wang Yulan
【摘 要】目的:构建细胞分裂周期蛋白(Cdc42)的结构域突变质粒,即鸟嘌呤核苷酸交换因子(GEF)结构域突变质粒.方法:根据NCBI中小鼠Cdc42全长cDNA序列到结构域GEF,将GEF的氨基酸突变成丙氨酸,根据突变后的序列设计引物,PCR扩增得到目的片段588 bp,限制性内切酶EcoRI和HindⅢ双酶切后插入到编码红荧光蛋白(RFP)和his标签的真核表达载体PM-his-RFP中,构建PM-his-Cdc42(GEF)-RFP重组质粒,进行酶切电泳及DNA测序验证.用脂质体介导方法将重组质粒瞬时转染HT22细胞,通过荧光显微镜观察转染效率.结果:经酶切及测序结果显示突变后结构域插入的位置和序列正确,成功构建Cdc42蛋白GEF结构域突变质粒;荧光结果表明,重组质粒顺利转染HT22细胞.结论:成功构建的Cdc42结构域突变质粒为Cdc42蛋白的功能研究提供有效的操作工具.
【期刊名称】《解剖学杂志》
【年(卷),期】2019(042)003
【总页数】4页(P249-252)
【关键词】细胞分裂周期蛋白;鸟嘌呤核苷酸交换因子;结构域;真核表达质粒;突变后结构主义
鞍山卫生信息网【作 者】Li Zhenling;Wang Di;Song Yuanjian;Wang Yulan
【作者单位】;;;
【正文语种】中 文
细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle 42，Cdc42蛋白）是Rho家族蛋白成员之一[1]，可结合鸟嘌呤三核苷酸（GTP）[2]，作为哺乳动物细胞信号转导系统中重要分子的开关因子[3]，Cdc42蛋白在细胞骨架动态变化中具有重要的调控作用[4]。Rho GTP酶是一个小信号家族[5]，作为分子开关蛋白质，调节细胞骨架重组、细胞黏附、细胞活力、囊泡运输和吞噬作用[6]。其中Cdc42蛋白、Rac1和Rho A是研究最多的[7]。已有研究表明，Cdc42蛋白是与人类多种癌症相关的蛋白[8-10]，如乳腺癌，参与细胞周期进程、迁移、侵袭、肿瘤生长、血管生成和致癌转化等[11]。Cdc42蛋白结构域GEF是鸟嘌呤核苷酸交换因子相互作用位点，也是多肽结合位点[12]，将其突变后减少Cdc42蛋白的结合作用，可以减少与Cdc
42蛋白相关的破坏作用。本实验以构建Cdc42蛋白结构域突变的重组真核表达质粒为最终目的，为后续Cdc42蛋白的研究提供了有效的操作工具，为深入研究相关疾病提供基础。
1 材料和方法
1.1 主要试剂电影 深喉
PM-RFP-his载体、pfu高温聚合酶、dNTP mixture、50×TAE缓冲液、EZ-10 柱式DNA胶回收试剂盒、Top10 感受态细胞购自生工生物工程（上海）股份有限公司；无内毒素质粒小量提取试剂盒购自天根生化科技有限公司；琼脂糖B、低电渗、溴化乙锭购置BBI公司；限制性内切酶EcoRI、HindⅢ购自Themo Scientific公司；GeneRuler DNA Ladder Mix、T4 DNA Ligase购自Themo Scientific公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司；DMEM购自HyClone公司；胎牛血清购自杭州四季青生物制品厂；胰酶细胞消化液购自VIC-MED公司。
1.2 重组质粒PM-his-Cdc42（GEF）-红荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）的构建
1.2.1 确定目的基因 根据NCBI中小鼠Cdc42蛋白的基因序列，到结构域GEF，将结构域GEF的全部氨基酸突变成丙氨酸，具体的突变位点如下 ：T3A、K5A、E31A、Y32A、T35A、V36A、D38A、N39A、T43A、T52A、F56A、D57A、T58A、G60A、Q61A、Y64A、D65A、R66A、L67A、L70A、S71A、P73A、Q74A、H103A、H104A。
1.2.2 引物的设计与合成 以结构域GEF突变后的小鼠Cdc42蛋白的基因序列，用 Primer 5.0软件自行设计出引物。其序列如下：Forward Primer 5'-GAA TTCATGCAGGCCATCGCTTGTGTGGTGGT-3'，下划线部分表示EcoRI酶切位点；Reverse Primer为5'-AAGCTTTTACAGCAGCACGCATCTCCTG -3'，下划线部分表示HindⅢ酶切位点。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
1.2.3 目的片段扩增 根据结构域GEF突变后的小鼠Cdc42蛋白的基因序列为模板，根据上述引物，利用PCR扩增仪进行扩增，PCR反应采用的是pfu高温聚合酶。第1轮PCR程序为：95 ℃预变性3 min；95℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，进行20个循环 ；72 ℃延伸5 min。以第1轮的产物继续扩增，第2轮PCR程序为：95 ℃预变性3 min ；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72℃ 60 s，进行25个循环；72 ℃延伸5 min。得到最终的PCR产物，大小为588 bp，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，并用EZ-10 柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化。
1.2.4 PM-his-Cdc42（GEF）-RFP 质粒构建及鉴定 用限制性内切酶EcoRI与HindⅢ双酶切PCR回收产物及PM-his-RFP载体。经1 %凝胶电泳后，回收酶切产物。将酶切回收PCR产物及载体放入37 ℃恒温水浴锅中反应1 h。将回收纯化好的目的DNA片段及载体，进行连接。连接体系共20 μl，其中PCR回收产物50 ng，载体30 ng，10×T4 DNA Ligase Buffer 2 μl，T4 DNA Ligase 1 μl，ddH2O补充至20 μl。将上述混合液置于16℃孵育1 h。将上述连接液转入one-shot感受态中，于Amp+（氨苄青霉素）的LB培养基中选择培养，次日随机挑选阳性单克隆菌落，于Amp+ LB 液态培养基摇菌过夜，隔日无内毒素质粒小量抽提试剂盒小提质粒，行 EcoRI、HindⅢ 双酶切鉴定，并进行测序，DNA测序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。
1.3 细胞培养及质粒转染
HT22细胞培养于含10 %胎牛血清的DMEM高糖培养基中，培养箱条件：37 ℃、5 % CO2。质粒转染前24 h在6孔板中接种细胞，浓度为5 ×108/L，每孔2 ml ，待细胞混合度达80 %～90 %时进行转染。转染48 ～72 h后，荧光显微镜下观察转染效率。
中华女子学院山东分院2 结果
2.1 目的基因扩增
目的基因经PCR扩增后，1 %琼脂糖凝胶电泳可见1条约588 bp的特异条带，即为结构域GEF突变后的Cdc42蛋白，与预计结果符合（图1）。回收纯化的载体经1%琼脂糖凝胶电泳可见1条约3.5 kb的条带，即为PM-his-RFP载体，其分子量约3.5 kb（图2）。
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图1 以结构域GEF突变后小鼠Cdc42基因序列为模板，经PCR扩增后得到目的基因，大小约为588 bpFig1 According to the sequence of Cdc42 mutant in the GEF domain，the target gene was amplified by PCR，the size of which was about 588 bp
图2 载体PM-his-RFP回收纯化后经1 %琼脂糖凝胶电泳，可见1条约3.5 kb的条带，载体PM-his-RFP的分子量约为3.5 kbFig2 After recovery and purif i cation of PM-his-RFP，a band of about 3.5 kb was observed by 1% gelatin agar electrophoresis.The molecular weight of PM-his-RFP was about 3.5 kb.
2.2 构建PM-his-Cdc42（GEF）-RFP真核表达质粒
PM-his-RFP载体分子量约3.5 kb，目的片段588 bp。PM-his-Cdc42（GEF）-RFP突变质
lte-a
粒小提经EcoR I、HindⅢ 双酶切鉴定，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，酶切片段大小与预期吻合（图3）。经测序鉴定证实，插入片段的测序结果与设计的序列完全一致，未发现有插入缺失及突变。
图3 PM-his-Cdc42（GEF）-RFP突变质粒小提经EcoR I、HindⅢ 双酶切鉴定，1 %琼脂糖凝胶电泳检测，PM-his-RFP载体分子量约为3.5 kb，目的片段分子量大小约为588 bpFig3 PM-his-Cdc42（GEF）-RFP mutant plasmid was identified by double enzyme digestion of EcoRI and Hind Ⅲ，and 1% agarose gel electrophoresis showed that the molecular weight of PM -his-RFP vector was about 3.5 kb，and the molecular weight of target fragment was about 588 bp
2.3 PM-his-Cdc42（GEF）-RFP重组质粒转染HT22细胞
重组质粒 PM-his-Cdc42（GEF）-RFP 通过Lipofectamine 2000脂质体瞬时转染，通过荧光显微镜观察显示，重组质粒成功转染入HT22细胞（图4）。
图4 PM-his-Cdc42（GEF）-RFP重组质粒转染HT22细胞，标尺=100 μmFig4 Transfectio
n of HT22 cells with PM-his-Cdc42（GEF）-RFP recombinant plasmid，bar=100 μmA ：Open-field cytogram of HT22 cells；B ：Red fluorescence of recombinant plasmid PM-his-Cdc42（GEF）-RFP；C：Immunofluorescence staining of HT22 cells transfected with recombinant plasmid
3 讨论
Cdc42蛋白属于小G蛋白Rho家族蛋白重要的一员[13]，激活小G蛋白可以作用于相应的效应底物而影响细胞正常的生长、分化[14]，引起一系列严重的破坏作用。已有研究表明，Cdc42蛋白参与多种信号通路的传导[9,15-16]，例如Cdc42蛋白处于激活状态时，可以与相应的效应器或靶分子结合，通过激活 JNK 信号通路，对脑缺血后的神经细胞产生损伤作用等[17]。然而，如何阻断Cdc42蛋白的信号传导仍然未知，因此致力于研究Cdc42蛋白是有重要意义的。
GEF是Cdc42蛋白的重要结构域，同时结构域GEF是鸟嘌呤核苷酸交换因子相互作用位点，也是多肽结合位点[12]，将结构域GEF的氨基酸突变成丙氨酸，使该结构域丧失活性，假设突变该结构域后可以阻断Cdc42蛋白与后续蛋白的结合，进而中止Cdc42蛋白参
与的信号通路的传导，就可以减少与Cdc42蛋白有关的破坏作用。
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