实验目的
1.掌握通过酶切与PCR扩增鉴定重组DNA分子的基本方法。 2.学习和掌握PCR扩增的基本原理和实验技术。
实验原理
1.酶切法鉴定重组DNA
重组质粒是外源基因通过单酶切（或双酶切）与用相同的（或两种）限制性核酸内切酶切割的质粒载体连接后获得的，因此在连接处仍保留原限制性核酸内切酶的识别序列，用该酶（或两种酶）再次切割重组质粒，能把插入片段切离载体，根据琼脂糖凝胶电泳检测可见有载体片段和插入的外源DNA片段，并可知插入片段的大小。 2.PCR扩增法鉴定重组质粒
PCR反应可以用来鉴定载体上是否重组了外源DNA片段，并可估测外源插入片段的大小，。根据载体多克隆位点上下游基因的序列设计一对PCR引物，两引物之间的距离即是空载体PC R扩增的大小，如果在多克隆位点内插入外源DNA片段，就会改变PCR扩增产物的大小，扩增产物的大小减去两引物之间的距离即是插入片段的长度，也可以直接基于外源DNA两端的序列设计一对引物，分分别以空载体和重组质粒为模板进行PCR反应，只有重组质粒能扩增出一定大小的产物，则该产物的大小即是插入片段的大小。 3.PCR扩增原理
具有模板DNA，寡核苷酸引物，Mg2+，4种脱氧核糖核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和缓冲液所有组分的PCR反应体系中，在模板变性，引物退火后，模拟体内半保留复制过程——即在DNA聚合酶的作用下，以变性单链为模板，依据碱基互补配对原理，在引物的3’端加入合适的核苷酸分子，不断延伸直至完成新DNA的合成。新合成的DNA分子也可以作为模板，参与后续的扩增反应，使目的分子呈指数增长。因此，变性、退火和延伸循环反复25~30次后，即可以从少量的模板DNA中扩增出大量的目的产物。
PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5’端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA
为模板，引物是从3’端开始延伸，其5’端是固定的，3’端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5’端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3’端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。
主要仪器和试剂
1.仪器和材料
微量移液器，吸头和吸头盒，37℃恒温水浴锅，PCR扩增仪，高速离心机，微波炉，电泳槽，电泳仪，Eppendorf管（1.5mL，0.2mL），制胶槽，梳子，锥形瓶，量筒，冰盒，手套，记号笔，凝胶成像检测仪等
2.实验试剂
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酶切检测：重蒸水，限制性核酸内切酶HindⅢ（15U/μL），限制性核酸内切酶缓冲液（10×M Buffer），Re-pUC19等。
PCR检测：TaqDNA聚合酶（5U/μL），PCR反应缓冲液（10×Buffer），dNTP混合物，重蒸水，M13F(10μM)，M13R(10μM)，Re-pUC19（约10ng/μL）等。
琼脂糖凝胶电泳试剂：6×上样缓冲液，TAE缓冲液，琼脂糖，DNA标准Marker（λDNA/HindⅢ），DL2000 Plus，溴化乙锭EB等。
实验步骤
（一）重组质粒的酶切验证
1.对于电泳显示插入片段在2.0kb以上的重组质粒，采用以下酶切体系进行验证：
成分 | 大片段或高产量（μL） |
ddH2O | 6.2 |
10×M Buffer | 1.0 |
Re-pUC19 | 2.0 |
HindⅢ | 0.8 |
共计 | 10.0 |
轻弹混匀后，短暂离心，37℃保温2hr后，保存于-20℃，备电泳检测。 |
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表一：大片段酶切反应体系
2.对于电泳显示插入片段在2.0kb以下的重组质粒，不推荐使用酶切法进行验证，如若使用，则是适当更改反应体系：
成分 | 小片段或低产量（μL） |
| 严控未成年真人秀 ddH2O | 11.0-9.0 |
10×M Buffer | 2.0 |
Re-pUC19 | 6.0-8.0 |
HindⅢ | 1.0 |
共计 | 20.0 |
轻弹混匀后，短暂离心，37℃保温2hr后，保存于-20℃，备电泳检测。 |
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表二：小片段酶切反应体系
3.利用空载体片段和目的基因片段作为对照，对酶切后重组质粒的片段进行琼脂糖凝胶电泳检测，从酶切后的片段的数目及大小上进行确认：
◆ 大片段：10.0μL酶切产物+2.0μL 6×Loading Bf，混匀→取6.0μL点样，电泳，染，检测。
◆ 小片段：20.0μL酶切产物+3.0μL 10×Loading Bf，混匀→取12.0-13.0μL点样，电泳，染，检测。
（二）重组质粒的PCR验证/PCR扩增目的基因
对于电泳电视插入片段在2.0kb以下的重组质粒，推荐采用PCR进行验证。
1.以提取的质粒为模板，加入合成的引物，进行PCR反应，其反应体系如下：
成分 | 小片段或低产量（大体系，μL） |
ddH2O | 13.6 |
| 睡眠日记 10×Buffer | 2.0 |
dNTP（2.5mmol each） | 1.6 |
M13F(10DμM) | 0.8 |
M13R(10DμM) | 0.8 |
模板（约10ng/μL） | 1.0 |
Taq酶 | 0.2 |
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轻弹混匀后，短暂离心，进行PCR，PCR后保存于-20℃，备电泳检测。 备注：取1μL质粒+49μLddH2O（即稀释50×），然后从中取1μL作为PCR的模板。 |
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表三：PCR反应体系
2.PCR反应程序：
①94℃ ，变性3min ；②94℃ ，变性30s ；③58℃ ，复性30s ； ④72℃ ，延伸1min，转⑵，循环29次；⑤72℃ ，延伸10.0min；⑥4℃，保存。
3.PCR反应产物琼脂糖凝胶电泳检测（1％的琼脂糖凝胶）
PCR反应结束，用 DL2000 plus作对照，电泳，确定PCR产物的大小：
云南中医学院教务管理系统20.0μL PCR产物+3.0μL 10×Loading Bf，混匀→取5.0μL点样，电泳，染，检测。
4.产物长度预测
PCR扩增产物的长度（bp）=载体pUC19上两引物间序列的长度(150bp)+插入片段的长度。
实验结果
（一）重组质粒的酶切验证电泳结果：
泳道 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | … | 21 | 22 |
样品 | | 威廉姆斯λ/HindⅢ (Marker) | JD-1 R1 | JD-1 R1/HindⅢ | JD-1 R2 | JD-1 R2/HindⅢ | JD-2 R1 | JD-2 R1/HindⅢ | … | pUC19 /HindⅢ | λ/HindⅢ(Marker) |
样量（µl） | | 6.0 | 2.0 | 6.0 | 2.0 | 6.0 | 2.0 | 6.0 | | | 6.0 |
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表四：从左至右各泳道的样品及样量（酶切）
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