• 12 •Modern Practical Medicine, January 2021, Vol.33, No. 1
•临床研究*
TLR4受体抑制剂对脂多糖促进人黑素瘤
郑增光，王鹏雁
【摘要】目的探讨Toll样受体4 (TLR4)对脂多糖(LPS)促进人黑素瘤A375细胞增殖和迁移的影响。方法将 黑素瘤A375细胞分为空白对照组、LPS组、TLR4抑制组(Resatorvid)及Resatorvid+LPS组;Westem-bolt检测
TLR4的表达，然后使用CCK8法检测细胞存活率，通过Transwell法检测各组细胞的迁移能力，同时ELISA检测 稀土在线
细胞上清液中IL-10的表达水平。结果与对照组相比,LPS组TLR4的表达明显升高,A375细胞增殖迁移能力
增强，同时细胞上清液IL-10表达上调(均0.05);Resatorvid能抑制TLR4的表达，降低A375细胞增殖和迁
移
能力，同时细胞上清液IL-10表达下调(均户< 0.05)；抑制TLR4表达后，再给予LPS刺激，与LPS组相比，细胞的
增殖和迁移能力明显减弱，同时IL-10表达下降（均P<0.05)。结论LPS可通过激活TLR4受体促进A375细
胞增殖和迁移，抑制TLR4的表达，可阻断LPS对A375细胞的增殖和迁移，其作用机制可能是通过影响肿瘤免疫 微环境而发挥作用。
【关键词】黑素瘤;TLR4；细胞增殖;IL-10
doi:10.3969/j.issn,1671-0800.2021.01.005
【中图分类号】R730.2;R75【文献标志码】A【文章编号】1671-0800(2021)01-0012-03
恶性黑素瘤是恶性程度极高的皮 肤黏膜恶性肿瘤，常起病隐匿，不易引起 重视，确诊时多有淋巴
结或远处转移，5 年生存率仅16%m，且发病率有逐年升高 趋势R1。Toll样受体(TLRs)是一种模式 识别受体，广泛存在于人体免疫细胞及 多种上皮细胞中。最近研究表明多种肿 瘤细胞表面亦表达TLRs，且与肿瘤的发 生、发展及转移密切相关1M1。TLR4是 TLRs受体家族中的一员，可通过与配体 [如脂多糖（LPS)]结合促进炎症介质的 合成与释放。有研究表明TLR4可促进 乳腺癌、卵巢癌及肺癌等肿瘤的增殖、转 移及免疫逃逸lwl。近年发现TLR4在 恶性黑素瘤组织中的表达比例较高, TLR4的表达增高与患者预后差相关|7_81。然而,TLR4在黑素瘤中发挥何种作用 尚不明确。本研究拟采用LPS刺激A375 细胞，模拟慢性炎症的细胞微环境，探讨 基金项目：浙江省卫生科技面上项目(2018252439)
作者单位：310022杭州，中国科学院 大学附属肿瘤医院（浙江省肿瘤医院）(_郑增 光）；浙江医院（王鹏雁）
通信作者：郑增光，Email: 6052851 *********抑制TLR4的表达对黑素瘤A375细胞
增殖、迁移的影响及其可能的机制，以期
为恶性黑素瘤新的靶点提供理论
依据。现报道如下。
1资料与方法
1.1材料人黑素瘤A375细胞株购
自上海中科院细胞库；青霉素-链霉素溶
液（美国Gibco公司）、细胞计数试剂盒
CCK8 (日本同仁生物公司）；胎牛血清、
DMEM细胞培养基(美国Gibco公司）；
LPS(Sigma公司）；Resatorvid(Selleck公
司）；抗体 TLR4、P-actin(CST 公司）；
IL-10 Elisa试剂盒(酶联生物公司）。
1.2方法
1.2.1细胞培养A375细胞株采用含
10%胎牛血清(FBS)、100 U/ml青霉素和
100 H g/m l链霉素的DMEM培养基，在
5%C〇2,37 °C恒温箱内培养，取其对数
生长期用于实验。其中对照组细胞仅接
受10%胎牛血清的DMEM培养基培养。
其他组除10%胎牛血清的DMEM培养基
外，另加一定量的LPS和Resatorvid并调
整相应药物浓度，LPS组(LPS 5 ng/ml)、
TLR4 抑制组(Resatorvid 100 jimol/L)、
LPS+Resatorvid组(LPS 5 ng/ml+Resat-
orvid100 |xmol/L) 〇
1.2.2 Western blot检测 A375 细胞蛋
白表达量各组细胞根据分组情况’继续
培养48 h，使用细胞裂解液裂解细胞，然后
离心，吸取上清，用二喹啉甲酸(BCA)法
检测细胞蛋白浓度。在十二烷基硫酸钠
(SDS)凝胶上对每组取20 |〇g蛋白上样,
在200 V恒压中电泳，直到溴酚蓝迁移至
分离胶下缘时(时间约为40 min)，关掉电
源，停止电泳。然后经过转膜/封闭，再依
次分别加入T L R4、^actin—抗，孵育过夜,
洗膜，使用二撕育2h’化学光敏模式曝光
照片以UEF格式导出后在Im agpJ
软件下分析各条带灰度值，以TLR4与屮
actin灰度值比值表示各组TLR4蛋白的
相对表达量。实验重复3次。
1.2.3 CCK8实验检测细胞增殖率制
备细胞悬液，将计数细胞接种到96孔板
中，待测细胞调密度至铺满孔底70%左
右，设置3个重复。将96孔平底板置于
5%C〇2, 37 °C培养箱中培养24 h，加入
10 M l CCK-8 (日本同仁公司），继续培养
1 ~ 4 h，形成结晶。使用酶标仪450 nm
波长检测吸光度（A)值，计算细胞相对
增殖率。相对增殖率(％)=(实验组谢照
组)x l〇〇%。实验重复3次。
现代实用医学2021年1月第33卷第丨期• 13 •
1.2.4 Transwell法检测细胞迁移能力
将300 jil无血清培养基加入到小室上层，在其下层加入800 jil培养基,37 °C 细胞培养箱静置2 h，将饥饿处理24 h的细胞进行计数，采用无血清的培养基稀释 细胞密度为lxlO5/ml。去除活化时所用 的培养基，分别在小室下层加入800 jil 10%FBS培养液，而小室的上层则加入 300 jil细胞悬液。在37 °C培养箱中培 养细胞24 h后，使用4%甲醇对细胞进 行固定20 min，然后进行结晶紫染。显微镜下拍照040)，随机选取3〜5个 视野计数。实验重复3次。
1.2.5 ELISA法检测IL-10的表达水平
各组A375细胞培养48h后离心取细胞上清液，按照ELISA试剂盒说明书测 定IL-10含量。采用酶标仪绘制标准曲 线，并计算结果。实验重复3次。
1.3统计方法采用SPSS220统计软件 进行分析，it*®料以糊_雅差表示，多 组比较采用单因素方差分析，两两比较采用 L sm检验vP<0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1 LPS和 Resatorvid对 A375 细胞中 TLR4蛋白表达的影响L PS组TLR4 蛋白表达高于空白对照组（P< 0.05), Resatorvid组TLR4蛋白表达低于空白 对照组（P< 0.05); Resatorvid+LPS组 A375细胞TLR4蛋白表达低于单纯LPS 组(P<0.05)。见图1及表1。
2.2 LPS和 Resatorvid对 A375 细胞增 殖的影响LPS组A375细胞相对增殖 率高于空白对照组CP<0.05), Resatorvid 组 A375 细胞相对增殖率低于空白 对照组（P< 0.05), Resatorvid+LPS组 A375细胞相对增殖率低于单纯LPS组 CP<0.05)。见表 1。
2.3 LPS和 Resatorvid对A375 细胞迁移 的影响LPS组A375细胞迁移力高于空 白对照组(P<0.05),Resatorvi组A375 细
图1各组A375细胞TLR4蛋白的表达胞迁移力低于空白对照组<0.05); Re>
satorvid+LPS组A375细胞迁移力低于LPS
组(P<0.05)。见封二彩图3〜6及表1。
2.4各组IL-10的表达情况L P S组
IL-10水平高于空白对照组(P< 0.05),
Resatorvid组IL-10水平低于空白对照
组(P< 0.05),Resatorvid+LPS组 IL-10
水平低于LPS组C P< 0.05)。见表1。
3讨论
TLRs是一类天然的免疫受体，最突
出的生物学功能是促进细胞因子的合成
与释放，大量研究显示生物的炎症介质
与LPS诱导下TLR4信号通路激活密切
相关。TLR4在肾细胞癌、宫颈癌及肺癌
等多种肿瘤及细胞系中过表达，与肿瘤
的生长和侵袭迁移密切相关15 wul。有研
究表明TLR4的表达与恶性黑素瘤的
进展、化疗耐药及预后差相关|sm。Resat
orvid (又名 TAK-242) 是一种选择性的
TLR4信号传导抑制剂，能抑制TLR4及
下游信号MyD88的表达。本研究笔者
通过在人黑素瘤A375细胞系中使用
TLR4受体抑制剂Resatorvid，结果显示
与空白对照组相比，Resatorvid组TLR4
蛋白表达下调,A375细胞的增殖和迁移
能力明显减弱（均•？< 0.05); LPS刺激
A375细胞后,TLR4蛋白表达增加,A375
细胞的增殖和迁移能力明显增强（均户
<0.05)；加入Resatorvid后，再给予相同
浓度的LPS刺激，与LPS组相比,TLR4
的表达下调，同时A375细胞的增殖和迁
移能力明显下降(均0.05)。
IL>10是肿瘤发展过程中的重要免疫
抑制因子，主要由T K2细胞、单核/巨噬细
胞及B淋巴细胞等合成分泌。研究表明
IL>10参与肿瘤的免疫抑制niB1，一方面通
过抑制肿瘤细胞表面MHC I类分子的表
达，影响CTL对肿瘤抗原的识别而发挥
免疫逃逸作用；另一方面通过降低肿瘤细
麟N K细胞的敏感性而发挥作用。有
研宄发现黑素瘤肿瘤组织中IL-10高2019理论韩国理论中文
表达W l。本研究结果显示A375细胞系存
在IL-10的表达，与空白对照组相比,Re
satorvid抑制 TLR4 的表达后,IL-10 的表
达相应降低（P<0.05); LPS激活A375
细胞上TLR4表达后，H0的表达增加
(P<0.05)；加入Resatorvid后再给予相
同浓度的LPS刺激，与LPS组相比,IL-10
的表达下调(P<0.05)。
综上所述，TLR4抑制剂Resatorvid
能明显抑制TLR4的表达，抑制黑素瘤
A375细胞的增殖及迁移能力，其作用机制
可能是通过影响肿瘤触微环境中免疫抑
制因子的表达实现的。T L R4受体有可能
成为恶性黑素瘤潜在的好IK点。
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lung cancer via TLR4/NF-k B signalling 表丨各组A375细胞增殖、迁移能力及TLR4 J L-10的表达水平比较
组别T L R4蛋白/相对增殖率迀移力IL-10
(p-actin)(%)(个/40倍视野）((jg/ml)
空白组〇.66±0.06100.00±6.47185.00±18.03481.31±18.16
L P S组0.89 士o.o r128.29士7.35*328.33士 17.56s667.06±9.68* Resatorvid 组0.46±0.04"48.32士0.32s"102.33士7.5 广323.56±5.76" Resatorvid+LPS 组0.55±0.09"58.40i3.13"151.67±7.64"518.3^32.76^
f值544.11156.92151.35161.22
Z5值<0.05<0.05<0.05<0.05
注：与对照组比较/户< 0.05；与LPS组比较，屮<
0.05
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收稿日期=2020-10-14
(本文编辑：陈志翔）
髓系来源抑制性细胞对非小细胞肺癌患者疾病 进展和预后的评估价值
黄威，王芝涛
【摘要】目的探讨髓系来源抑制性细胞(MDSC)在非小细胞肺癌(NSCLC)患者中的表达水平，以及与疾病进展和 预后的关系。方法收集62例NSCLC患者为研究对象(实验组)，选取同期30例健康体检者为对照组。采用流 式细胞术检测两组受试者外周血MDSC的表达水平；分析MDSC与初诊NSCLC患者年龄、性别、TNM分期、病 理分型、乳酸脱氢酶(LDH)、淋巴结转移及总生存期(OS)的相关性。结果NSCLC患者外周血MDSC表达水平 明显升高(？< 〇.〇5);MDSC表达水平与NSCLC患者TNM分期、LDH水平及有无淋巴结转移密切相关(均P< 0.05)；初诊NSCLC患者经外科手术后，MDSC表达水平较手术前下降C P< 0.05)。NSCLC患者MDSC水 平与OS呈负相关C P< 0.05)，且高表达MDSC的NSCLC患者OS低于低表达患者(P< 0.05)。TNM分期、淋 巴结转移及MDSC水平是影响O S
的不良因素和独立危险因素。结论MDSC在NSCLC患者中处于高表达状 态，并且与肿瘤进展密切相关；此外,MDSC可以作为评估NSCLC患者疗效及预后的新指标。
【关键词】非小细胞肺癌；髓系来源抑制性细胞；免疫逃逸；预后
doi:10.3969/j.issn,1671-0800.2021.01.006
【中图分类号】R734.2【文献标志码】A【文章编号】1671-0800(2021)01-0014-03
肺癌是最常见的恶性肿瘤之一，是导 致男性癌症患者死亡的最主要原因m。非
基金项目：安徽省自然科学基金(2008085QH372)
作者单位：315040宁波，宁波大学附属人民医院（黄威)；安徽医科大学第二附属医院(王芝涛）
通信作者：王芝涛，Email: aydxyk@ 163 小细獅癌C N S C L C)是最常见的肺癌亚
型，约占所有肺癌的85b/»。多数NSCLC患
者被确诊时常已经处于肿瘤晚期，
肺部以外器官转移' 对于此类患者，往往
缺乏有效的手段，效果极差。目
前，国内外有关NSCLC的病因及发病机制
尚缺乏统一观点。因此，深入研究NSCLC
患者的发病机制及寻一种有效、可靠的
祀点具有重要的医学价值。髓系来源
抑制性细胞(MDSC)是一现并具
有免疫抑制功能的髓系细胞亚' 已有
多项研究表明，MDSC通过抑制宿主的先
天和获得性触功會誅减弱宿主的碰瘤
免疫反应4,。前丽究表明’MDSC在膀胱
癌'乳勘T、胰腺癌7等患者中麗异常增
多’并且与麵的腦及预后密切相关。然
而,MDSC在NSCLC患者中的作用研究,
目前鲜有报道。本研究旨在探讨MDSC
李梅，于建娟，王耀帅.不同灸温的调脂控炎效应及与瞬时受体电位通道香草酸亚型1的关系研究(见正文第9页)
/-0.593 P =0.000
109
102
95
88 81§ 74
67
60<
尸0.573 7M 3.000
116
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o -$ 84
U 76
2 68
60
/-0.585 P =0.000
25
50
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100
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25
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25
50
75
100
150
Gensini 积分(分） Gensini 积分(分）
Gensini 积分(分）
图8 CHD 组血清C lq 、IMA 、M C P-l 水平与Gensini 积分的相关性
w m m
心'齡.A 4v ^
图 3 Transwell 小室空白对照组图 4 Transwel 丨小室 LPS 组 A 375 图 5 Transwell 小室 Resatorvid 图 6 Transwell 小室 Resatorvid +
A 375细胞穿膜细胞数（结晶紫染细胞穿膜细胞数（结晶紫染组A 375细胞穿膜细胞数（结晶LPS 组A 375细胞穿膜细胞数（结
，x 40)
,x 40)
紫染，40)
晶紫染,x 40)
黄威，王芝涛.髓系来源抑制性细胞对非小细胞肺癌患者疾病进展和预后的评估价值(见正文第14页）
80
g
U 〇〇
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20
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北京新世界百货店庆> 29.33
P < 0.01
设备名称:WZ -2300R X 记录仪开始时间:2015-06-14 14:25:40
通道 01[°C ] 结束时间:2015-06-14 14:36:40
打印时间:2015-12-01 10:18:439
图1 38°C 艾灸实时温度曲线
20
40 60 20
40 60
O S (个月）
O S (个月）
A
B
图7初诊NSCLC 患者外周血MDSC 与O S 的相关性分析 注:A 为相关性分析，B 为生存曲线分析
谢明斌，徐正明，李倩晓，等.冠心病患者血清补体C lq 、IMA 及MCP -1的表达及与冠状动脉狭窄的相关性分析(见正文第26页)
50.0047.0044.0041.0038.0035.0032.0029.0026.00 23.00
49.00
47.0045.0043.00 ^ 41.00 B 39.00 ® 37.00 ^ 35.00
33.0031.0029.0027.00
郑增光，王鹏雁.TLR 4受体抑制剂对脂多糖促进人黑素瘤A 375细胞增殖和迁移的影响(见正文第12页)
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