王焕南(综述);白波;陈京(审校)
【摘 要】G protein-coupled receptors ( GPCRs) are transmembrane proteins with important pathological and physiological functions.G protein-coupled receptor kinases (GRKs),protein kinase C (PKC) and β-ar-restin are closely related to G protein-coupled receptor phosphorylation.The process of GPCR phosphoryla-tion selectively activates G protein-dependent or G-protein-independent signal transduction pathways,which shows the characteristics of the biased receptor/ligand.In addition, new technologies, such as biolumines-cence resonance energy transfer and Duolink etc.,furtherly promote the research of GPCRs phosphorylation. In this review,the effects of GRK,β-arrestin and PKC on the phosphorylation of GPCR and phosphorylation of GPCR were summarized.The application of newly found technologys in GPCR phosphorylation were also discussed,which provides a theoretical foundation to further understand GPCR physiological and pathological function and drug development.%G蛋白偶联受体（ G protei
catptn-coupled receptors ，GPCR）是具有重要生理病理功能的跨膜受体蛋白。GPCR磷酸化与G蛋白偶联受体激酶（G protein-coupled receptor kinases，GRKs）、蛋白激酶C（proteinkinase C， PKC）及β抑制蛋白（β-arrestin）密切相关。 GPCR发生磷酸化可选择性的激活G蛋白依赖或G蛋白非依赖β-arresin信号转导通路，因而表现出偏向性受体／配体的特点。生物发光共振能量转移（ bioluminescence resonance energy transfer，BRET）及Duolink等新技术的应用，推进了GPCR磷酸化的研究进程。本文简要综述了GRK、β-arrestin、PKC等对GPCR磷酸化的作用及GPCR发生磷酸化后对偏向性信号转导的影响，并探讨了目前研究GPCR磷酸化的最新技术，为进一步了解GPCR生理病理功能和药物研发提供理论基础。 【期刊名称】《济宁医学院学报》
【年(卷),期】2016(039)006
【总页数】5页(P416-420)
【关键词】G蛋白偶联受体;磷酸化;信号转导;生物发光共振能量转移;Duolink
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【作 者】王焕南(综述);白波;陈京(审校)100crypts攻略
【作者单位】曲阜师范大学，曲阜 273165;济宁医学院神经生物学研究所，济宁 272067;济宁医学院神经生物学研究所，济宁 272067
【正文语种】中 文
【中图分类】Q51
张承志
G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptor，GPCR)为7次跨膜蛋白，是人体内最大的膜受体，可与激素、多肽等多种配体相互作用。GPCR与不同配体作用后，可激活细胞内不同亚型的G蛋白进行信号转导，最终将细胞外信号传递到胞内，进而调控各种生物反应[1]。GPCR结构和功能调控与多种蛋白激酶相关。GPCR发生磷酸化能够影响其信号转导与相关蛋白分子的作用，对GPCR活性及疾病的生理、病理机制发挥重要的调节作用。本文将简要综述GPCR磷酸化的作用机制及GPCR发生磷酸化后对其信号转导的影响，并进一步探究了近年来研究GPCR磷酸化的新技术。
蛋白质磷酸化是调控细胞生命周期的关键环节，对细胞的功能具有极其重要影响。GPCR李盛才
的磷酸化多发生在第三胞内环及C末端的丝氨酸/苏氨酸残基，从而影响GPCR在细胞内的转运、信号转导、脱敏及内化等活动。GPCR磷酸化异常将引起受体的活性及灵敏度降低，甚至导致帕金森症、阿尔茨海默症、心血管疾病、侏儒症以及糖尿病等多种疾病的发生。因此，对GPCR磷酸化研究，将对相关疾病生理、病理机制的研究具有重要意义，为临床疾病提供重要的药物作用靶点。
1.1 G蛋白偶联受体激酶对GPCR磷酸化的作用
G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinases,GRKs)可分为7种亚型(GRK1-GRK7)。GRK1和GRK7在视网膜中表达，GRK4仅在睾丸中表达，而其他的GRKs家族成员(GRK2、GRK3、GRK5和GRK6)则在机体内广泛表达。 GRKs各亚型的氨基端、羧基端以及中心催化区结构高度相似,其中氨基端用于底物识别，可通过磷酸化调节G蛋白依赖的方式进行信号转导[2]。当激动剂持续刺激GPCR后，GRKs可使GPCR发生磷酸化，磷酸化的GPCR迅速与β-arrestin结合，形成GPCR/β-arrestin复合物，使GPCR与G蛋白解偶联，从而抑制G蛋白的活化，即发生脱敏[3-4]。GPCR脱敏可维持机体的生理平衡，但脱敏过程失调可能会导致多种疾病，如心脏衰竭、哮喘和自体免疫疾病等。研究表明，GRKs具
有广泛的底物特异性，不同的GRKs亚家族不仅可磷酸化不同蛋白的丝氨酸/苏氨酸残基，并且对同一种蛋白的磷酸化也具有差异性[5]。Florian等[6]通过构建内皮素受体A(ETA)C末端的磷酸化突变型受体，将突变型受体与GRK2共转染HEK293细胞进行研究，结果发现GRK2诱导ETA发生磷酸化。进一步研究证明，GRK2只参与介导了ETA的脱敏，而未参与ETA内在化。Sayaka等[7]对神经降压素I型受体(NTSR1)的体外实验研究表明， GRK2和GRK5 对NTSR1的磷酸化具有选择差异性。GRK2以激动剂依赖的方式磷酸化NTSR1，而GRK5对NTSR1的磷酸化则不依赖于激动剂的作用。有研究指出，GRK2只磷酸化受体C末端丝氨酸残基，而GRK5可磷酸化位于第三胞内环及C末端的丝氨酸/苏氨酸残基。值得说明的是，相比β2-肾上腺素受体和μ阿片受体，NTSR1突变体的磷酸化研究表明，对于其特定的磷酸化位点，GRK2不需要磷酸化该受体的酸性残基。因此，GRKs对GPCR磷酸化的差异性被认为是特定信号编码的结果。
1.2 β-arrestin对GPCR磷酸化的作用
β-arrestin是细胞内广泛存在的支架蛋白和衔接蛋白，在GPCR的脱敏-内化-复敏-再循环以及G蛋白非依赖的信号转导中具有重要的调控作用。G蛋白依赖的信号转导过程中，GPCR
受细胞外信号刺激并被激活，同时暴露出与G蛋白的结合位点，激活G蛋白。被激活的G蛋白各种亚型调节腺苷酸环化酶(AC)、磷脂酶以及离子通道等，从而将细胞外信号进行级联放大。GPCR与G蛋白和β-arrestin之间相互作用的程度决定了胞内信号转导的选择性[8]。β-arrestin作为磷酸化GPCR在细胞内结合的主要分子之一，可与GRKs联合作用，促使GPCR发生脱敏，进而调节受体内吞及信号转导等多种生物学功能[9-10]。
活化的GPCR被GRKs磷酸化后,与β-arrestin的亲和力显著增加，形成GPCR/β-arrestin复合物，此复合物在细胞内可存在几分钟至数小时。形成复合物后致使β-arrestin的构象发生改变，进而抑制GPCR与G蛋白的结合或者直接使GPCR与G蛋白发生解偶联，再通过β-arrestin介导的G蛋白非依赖途径进行信号转导。根据激动剂介导的β-arrestin与不同GPCR作用的强度和时间，可将GPCR分为两类，A类GPCR与β-arrestin形成的复合物是短暂的，受体发生内吞后迅速与β-arrestin发生解离，返回质膜，如β2-肾上腺素、μ-阿片类药物、内皮素A型受体等。相比之下，B类GPCR与β-arrestin的相互作用更稳定，这类受体复合物经过内涵体发生降解或缓慢循环到质膜，如神经降压素I型受体、血管紧张素Ⅱ的I型受体、血管升压素受体(V2R)等[11]。
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β-arrestin介导的GPCR内吞过程需要与网格蛋白(Clathrin)、衔接蛋白2(AP2)等相互作用。网格蛋白是蛋白质内吞过程中研究最早的核心蛋白，在GPCR的内吞过程中Clathrin可形成网格蛋白小窝(CCPs)，大多数GPCR内吞都需经过CCPs的形成过程，但是GPCR并不与Clathrin直接结合，而是由AP2作为分子桥梁，将二者联系起来。同样，β-arrestin也作为衔接蛋白对GPCR的内吞过程进行调控[12]。通过激光共聚焦显微镜观察发现，激动剂持续刺激30min或更长时间后，绿荧光蛋白标记的促甲状腺激素释放激素(TRH)受体与β-arrestin及网格蛋白在CCPs囊泡内共定位表达[13]。
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