论文摘要
作为模式识别受体，C型凝集素家族（CTLs）在识别和清除病原物的过程中扮演重要角。在本研究中，在中华绒螯蟹中发现一种新的CTL。根据从肝胰腺cDNA文库里分离得到的ESTs克隆得到该基因的全长。该基因全长为685bp 含开放阅读框（ORF）468bp，可编码155个氨基酸。氮端含有信号肽和糖类识别结构功能域（CRD）。通过实时定量PCR技术，检测该基因mRNA大量存在于肝胰腺中，在其他组织中很少甚至没有。经过脂多糖（LPS）的免疫刺激，该基因mRNA水平明显上调。该重组蛋白（rEsLecD）可以结合多种微生物，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。同时，钙离子的存在可以增强该重组蛋白对细菌的结合能力，但钙离子在结合实验中不是必须的。该重组蛋白与细菌的结合继而诱导病原微生物的凝集。另外我们检测到这种重组蛋白能够抑制细菌的生长，并且有一定的杀菌作用。更有趣的是，该重组蛋白可以引发血细胞体外包裹。总之本研究结果预示着，该凝集素蛋白作为抗菌模式识别受体分子，在无脊椎动物的非特异性免疫系统中，扮演重要角。 Lectins 作为一种模式识别受体（PRR），以细胞表面受体或者游离的可溶蛋白存在。在识别异己和清除病原菌方面扮演重要角。他们识别并非特异性结合到细菌表面的糖残基，从而引发细菌的凝集。Lectin因为不同的糖类识别结构域类型可以分为很多种。其中C型凝集素是用来描述一种依赖钙离子的糖类结合蛋白。C型凝集素通过典型的糖类识别结构域（CRD）与细菌表面糖残基结合并诱发一系列免疫应答。
avr单片机最小系统关键词：中华绒螯蟹，先天免疫，C型凝集素
ABSTRACT
C-type lectins as one of pattern recognition receptors play great roles in recognizing and eliminating pathogens in innate immunity.In this study, a novel C-type lectin (EsLecD) was identified from Eriocheir sinensis. The cloning of full-length EsLeD cDNA were based on the initial expressed sequence tags (EST) isolated from a hepatopancreatic cDNA library .The full-length cDNA of EsLecD was 686bp with an open reading frame of 468 bp encoding a putative protein of 155 amino acids with a N-terminal signal peptide and a single carbohydrate-recognition domain (CRD). The mRNA transcripts of EsLecD was mainly detected in hepatopancreas but not in other tissues by Reverse transcription-PCR analysis and post LPS immune challenge, the mRNA expression level in hemocytes significantly up-regulated. The recombinant EsLecD(rEsLecD) protein can bind to some Gram-positive, Gram-negative bacteria and Yeast and Calcium (Ca2+) can increase the binding activity, but not essential. rEslecD may bind to pathogen with a wide range. The recombinant protein can inhibit the grouth of the microorganism we tested at absent of Ca2+. Our results showed rEsLecD agglutinated some microorganism in a Ca2+-dependent manner. Except for the binding activities, rEsLecD could induce the aggregation but does not happen in the absence of Ca2+. It has
been shown that the rEsLecD could also stimulate hemocyte encapsulation. In conclusion, our study suggested that rEsLecD as a significant PRR have a part in recognizing invading pathogens in crabs and play a great role in innate immunity.
Keywords:
Eriocheir sinensis, innate immunity, C-type lectin
目录
论文摘要....................................................................................................................... V ABSTRACT ................................................................................................................. V I 第一章综述 (1)
第一节甲壳动物动物免疫系统 (1)
第二节C型凝集素简介 (5)
韩国新村第三节本研究的意义及技术路线 (12)
第二章EsLecD基因的序列以及表达模式分析 (14)
第一节EsLecD基因全长的克隆 (14)
第二节EsLecD基因的序列分析 (20)
积雪苷
第三节EsLecD表达模式分析 (24)
刘喀生第三章EsLecD的抗菌机制探讨 (28)
第一节重组载体构建以及重组蛋白的表达和纯化 (28)
第二节rEsLecD与细菌的结合以及钙离子依赖性分析 (35)
第三节rEsLecD抑菌和杀菌活性的分析 (44)
第四节rEsLecD凝集细菌活性分析 (46)
第五节rEsLecD参与血细胞包裹作用的分析 (48) 第四章总结及展望 (51)
参考文献 (53)
母猪性激素
附录 (61)
致谢 (62)
第一章综述
第一节无脊椎动物免疫系统
免疫系统一般分为天然免疫（natural immunity）和获得性免疫（acquried immunity），或者被称为先天免疫（innate immunity）和适应性免疫（adaptive immunity）。无脊椎动物缺乏适应性免疫系统，也就是说无法产生特异性抗体，也一直被认为没有免疫记忆。无脊椎动物例如甲壳动物，完全依赖先天性免疫抵御病原菌入侵。
1. 无脊椎动物的先天免疫概述
先天免疫系统即以细胞吞噬为主要的非特异免疫反应，通过高度保守的模式识别受体（pattern recognition receptors PRRs）来识别仅存在于微生物表面的保守的病原模式相关分子（pathogen-associated molecular patterns PAMPs）比如胞壁酸、葡聚糖、甘露糖，等等（Yokoo等，1995；de Silva等，2000）。PAMPs具有保守的结构，它们被不同的模式识别受体识别，通过如Toll通路、丝氨酸蛋白酶级联反应、凝集素(Toll pathway,cascade of serine proteases, agglutinins/lectins ），从而激
活免疫应答。多细胞无脊椎动物具有吞噬细胞，并且进化出更加复杂的免疫防御功能，比如调理作用、包裹作用、黑化和特殊的体液免疫应答。所有无脊椎动物都有先天的、自然的机体防御功能，这种防御功能具有非特异性、非预期性和非克隆性（Zänker 2010)。
2.细胞免疫
无脊椎动物血细胞通过主要组成成分的合作来识别异己，最常见的是细菌、真菌或其他寄生虫免疫细胞中揭露出的病原体相关分子模式（PAMPs），与模式识别受体（PRRs）结合来识别。主要有血细胞介导的免疫应答机制称为细胞免疫，包括吞噬（phagocytosis），结节（nodulation）以及包裹（encapsulation）。甲壳类动物的血细胞主要含有三种类型，包括透明细胞、半颗粒细胞和颗粒细胞（Johansson 等，2000）。
2.1吞噬作用（phagocytosis）
吞噬作用是血细胞中应对小分子颗粒如细菌、真菌和凋亡细胞等采取的免疫防御措施。其实质是单个细胞对颗粒的吞噬（Hernandez等1999）。吞噬过程是流通的或者静态防御的细胞活跃地吞噬一个或多个外来颗粒的过程，通常是针对细菌或者其他类似大小的颗粒。这个现象在动物界中普遍可以看到，一些无脊椎动物（尤其是一些滤食动物）的吞噬作用可用作营养物质的运输或摄食。该过程包括细胞表面识别异己物质、液泡内吞和排除，最终摧毁并释放到细胞外
2.2 成瘤和包裹作用
无脊椎动物血细胞发生大量凝集，而起到妨碍细菌入侵的作用称为成瘤作用。包裹或成瘤作用仅发生在无脊椎动物血细胞中。机体对于大的非己异物，无法直接吞噬，就通过发生大量凝集，从而达到阻止细菌入侵的目的（Lackie，1988）。将血细胞结合到较大入侵异物表面形成较大的凝集瘤，可以把异物包裹起来，称为包裹作用。通过血细胞凝集在入侵者外形成凝集瘤，随后这个被包裹的外壳发生黑化作用，最后将病原菌杀灭。成瘤和包裹是高效清除细菌的细胞免疫反应。反应过程被细胞粘着分子调节（如细胞黏附蛋白或整联蛋白），这些细胞粘着分子是由异己物质诱导识别后，颗粒细胞释放的(Johansson et al., 1995)。这些导致血细胞在异物表面黏在一起，形成一个由平整血细胞排列组成的外壳（鞘）。炎症细胞继续贴附于胶囊近12-36h直到异物完全被包围为止，激活由颗粒细胞胞吐产生酚氧化酶原，进而局部发生黑化作用。胶囊的形成通常伴随着循环免疫细胞数量可视性减少，一种情况被认为是血细胞减少。然而，这个是短暂的，在48-96h后血细胞数量通常恢复到正常水平，新细胞进入循环里，这些新细胞来自造血组织、血窦或者来自血液自身前体血细胞的增殖(Soderhall et al., 2003; Hammond and Smith, 2002)。
3.体液免疫
通过体液免疫抵御病原物入侵的免疫过程包括凝集血淋巴、激活酚氧化酶原系统和产生抗菌肽类分子
嘧霉胺
的。在体液免疫中，抗菌蛋白（antimicrobial proteins）、结合铁蛋白（iron-binding proteins）、酚氧化酶（phenoloxidase），金属蛋白酶（ matrix metalloproteases），小的效应分子例如活性的氧和氮中
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