野生动物学报Chinese Journal of Wildlife2021,42(2):575-584
Chinese Journal of Wildlife
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Toll样受体信号通路
在两栖类中的研究进展许晴#吴晨薇#李义军张晶饪柴龙会肖向红郝丽*
(东北林业大学，哈尔滨，150040)
稿件运行过程摘要:
收稿日期：2020-09-30
修回日期：2020-11-18
发表日期：2021-05-10
关键词：两栖类；
Toll样受体；
信号通路
Key words:Amphibians；
Innate immune system；
TLRs；
Signaling pathway
中图分类号：Q953
文献标识码：A
文章编号：
2310-1490(2021)02-575-10
两栖类处于脊椎动物由水生向陆生进化的过渡阶段，进化地位重要。近年来因疾病的爆发、生境破碎化、环境污染、紫外辐射增加、人为过度捕捉和生物入侵等诸多因素引起的全球范围内两栖类种数量锐减已引起人们的广泛关注。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)家族是一类从线虫到哺乳动物普遍存在的高度保守的模式识别受体(PRRs)，可以识别侵入机体病原体的病原相关分子模式(PAMPs)，是两栖类先天性免疫防御系统的重要组成部分。本文结合近些年国内外对两栖类TLRs的研究对两栖类TLRs结构特征、进化特点、在两栖类发育早期的差异表达特征和两栖类TLRs信号通路中相关分子的表达研究进行概述。目前对于两栖类TLRs的研究发现两栖类TLRs兼具鱼类和哺乳类TLRs的特征，并在从鱼类到两栖类到哺乳类的进化过程中，TLRs家族部分成员如TLR2的配体识别功能可能发生了一定程度的特化；在两栖类早期发育阶段，获得性免疫不够完善，以TLRs为主的先天免疫防御系统在抵御病原体的侵袭方面发挥了重要作用；在特定病原菌和病毒的胁迫下，可能激活了TLRs下游不同的途径参与两栖类对病原体的免疫应答反应。 Advances in the Study of the Toll-Like
Receptor Signal Pathway in Amphibians
XU Qing
*WU Chenwei
*LI Yijun ZHANG Jingyu
CHAI Longhui XIAO Xianghong HAO Li*
(Northeast Forestry University,Harbin,150040,China)
基金项目：国家自然科学基金项目(31271324)；黑龙江省科学基金项目(C2017011)；中央高校基本科研业务费专项资金项目(2572014EA05-03, 2572015CA18)
第一作者简介：许晴，女，24岁，硕士研究生；主要从事动物生理学研究。E-mail：2274397170@qq
*共同第一作者：许晴；吴晨薇
*通讯作者：郝丽，E-mail:haoli958@sina
576许晴等：Toll样受体信号通路在两栖类中的研究进展
Abstract：Amphibians are transitional species from aquatic to terrestrial lifeforms,which are key to
understanding of evolutionary history.In recent years,global amphibian populations have sharply
declined,presumably due to outbreaks of infectious diseases,habitat fragmentation,environ
mental polluti o n,in c reasi n g intensity of ultraviolet radiati o n,overharvesti n g,and biological inva
sion.The declines have aroused widespread concern.Toll-like receptors(TLR)form a class of
highly conserved pattern recognition receptors(PRRs)that recognize pathogen associated molecu
lar patterns(PAMPs).Animals from nemathelminths to mammals are considered to possess TLR全寿命周期
gen e s.TLRs are key comp o n e nts of the amphibia n innate immune system.We reviewed domes
tic and international literature on amphibian TLR research.Here,we discuss the structure,evolu-
tionary traits,differential expression during the early stage of amphibian embryo development,and
the expression of related molecular structures in TLR signaling pathways in amphibians.We found
that amphibian TLRs possess features of both fish-and mammalian-type TLRs.The ligand recog-
nition ability of TLR2(a member of the TLR family)was specialized in the evolutionary process from
fish to amphibia n s and mammals.The larva of amphibia n s always has in c omplete acquired immu
nity and TLRs are important in resisting the invasion of pathogens during the larval stage.Perhaps
d i ff
e re n t signal pathways are activated to participate in immune resp o n s es o
f amphibia n s to the
presenee of various bacteria and viruses.
1两栖动物生存现状
两栖类(Amphibia)动物隶属脊索动物门(Chor-date)，脊椎动物亚门(Vertebrata)，是脊椎动物由水生向陆生的过渡类，在地球上生存了3亿多年，进化地位重要⑷。两栖类躯体结构和机能以及行为等方面还不能很好地适应陆地环境，幼体在水中发育、成体水生或水陆兼栖的生活方式、体温不能保持恒定的生物学特性限制了其生存和分布，故而两栖类是脊椎动物中种类和数量较少的一个类现代两栖类皮肤裸露、腺体丰富，具有独特的生活史周期，相对于其他陆生脊椎动物其对环境变化更为敏感，常作为环境指示生物［2\1989年，在世界第一届爬虫学大会上，科学家们提出全球两栖类种呈现出衰减的趋势，该现象也在随后的研究中被证实并得到广泛的关注⑶。目前，两栖类动物种数量的减少已经成为一个全球性的问题⑷，世界自然保护联盟全球两栖类评估(GAA)结果显示：近几十年间，世界上近三分之一(32.5%,1856种)的两栖类物种受到威胁，至少2469(43.2%)种两栖类物种数量正在减少⑸。江建平等同2016年对中国408种两栖动物的濒危状况最新评估结果显示：中国两栖动物1种灭绝，1种区域灭绝，受威胁的物种共计176种，占评估物种总数的43.1%。
造成两栖类受威胁现状的原因有多种，如紫外辐射的增加、全球气候变迁、流行性疾病的爆发、生境破碎化、环境污染、人为过度捕捉和生物入侵等。以上多种因素相互作用加速了两栖类种数量的衰减。其中，有研究证明栖息地的丧失和真菌、病原微生物感染引起的疾病的流行是两栖动物种衰退的重要原因传染病的流行会迅速导致两栖类大规模的死亡，主要由细菌、真菌和病毒感染所致。1974—1982年，由于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)的感染导致了美国科罗拉多州当地的一种蟾
赊(地向bo-reas boreas)种数量大规模下降；1981年，同样是由于Ah的感染，美国罗德岛州木蛙(Rana sylvatica)卵
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几乎灭绝，造成该地区3年后没有成年木蛙在当地繁殖⑵。在澳大利亚和巴拿马，从濒死的无尾目(Anura)动物上分离出来的一种真菌壶菌(Batrachochy-trium dendrobatidis)，其定植于角质化的上皮，也会导致蛙类的大面积死亡⑷。20世纪60年代，在蝌蚪期的豹蛙(Rana pipiens)中发现一种可以感染多种两栖类动物的病毒，即蛙虹彩病毒(Rana grylio virus, RGV)，由于其高致病性和高致死率，被世界卫生组织列为必须申报的水生动物传染病⑼，国内外报道了多起虹彩病毒感染两栖类、鱼类以及爬行类动物的事件，导致了大规模传染性疾病的爆发［10-111o Pounds 等氏］的研究发现两栖类种中一些病原微生物的爆发与全球气候变暖有关，极端气候事件通过促进诸如壶菌类病原体的爆发而导致两栖类种数量的迅速下降。此外，许多致病微生物存在于健康的个体上，这些微生物可能帮助两栖类抑制体表致病真菌的生长，如蛙壶菌，但当个体的免疫系统遭到破坏时，疾病就会发生，大部分的条件性致病菌即是如此⑴］。所以许多生物学家认为，两栖类动物疾病的传播可能与环境的胁迫作用、免疫抑制、内分泌失调、寄主的变异以及传播方式的改变有关"⑷。
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2两栖类免疫系统
生物在长期的演化过程中逐渐进化出一套能够识别并抵御病原体入侵的免疫防御系统。两栖类动物的免疫系统与哺乳动物类似，主要包含先天性免疫和获得性免疫问O
2.1两栖类先天性免疫
先天性免疫作为机体抵御病原微生物的第一道防线，反应迅速，在机体发育过程中尤其是获得性免疫未完善之前起到重要的防御作用。脊椎动物主要是通过效应细胞上的模式识别受体(PRRs)识别病原体上保守的病原相关分子模式(PAMPs)，来激活免疫级联反应，促使机体释放多种可溶性介质以抵御病原菌的侵染，为机体提供最快速直接的免疫效应［16-17\目前，对于两栖类先天性免疫关注和研究最多的是皮肤活性肽的作用。在长期的进化过程中两栖类皮肤担任起调节水平衡、呼吸、抵抗猎食者、抗菌抗病毒、外分泌、调节温度、繁殖、逃避等多方面功能，以适应多样的环境变化，保持自身稳态平衡，是两栖类免疫防御的第一道防线。两栖类的皮肤可以分泌丰富的具有高度生物活性的分泌物，主要包括生物胺、生物碱、蟾赊配基、多肽和蛋白质4大类生物化学成分「如，其中数量最多种类最丰富的是生物活性肽和生物胺，据估计两栖类皮肤中含有超过10万种生物活性化合物少打两栖类皮肤活性肽平时储存于皮肤颗粒腺中，在机体受到压力或受伤时可以高浓度地释放到皮肤分泌物中发挥作用，目前根据两栖类皮肤活性肽的功能可分为抗菌肽、抗病毒肽、抗肿瘤肽、抗寄生虫肽、肌肽、阿片肽、免疫调节肽、伤口愈合肽、血管紧张素样肽等近20多个类别，功能涉及抗细菌、抗真菌、抗寄生虫、抗肿瘤、控制血压、调节水盐平衡、控制平滑肌收缩、镇痛、促进伤口愈合、调节免疫细胞功 能和细胞因子的合成等多个方面，具有开发为药物的巨大潜力，在临床方面的应用也越来越受关注。潮湿的生活环境和裸露皮肤使两栖类处于复杂的微生物环境之中，两栖类皮肤分泌的抗菌肽相互之间协同作用能够有效抑制革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、真菌以及某些耐药菌的定殖，具有广谱的抗菌活性，且由于其特殊的作用原理使微生物不易产生抗性「则。此外，当病原微生物入侵到机体内后，两栖类血液和组织内的巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞可以直接吞噬抗原微生物❾］。研究发现，蛙类的红细胞也具备吞噬入侵病原体的功能。
2.2两栖类获得性免疫
两栖类获得性免疫包括细胞免疫和体液免疫。以无尾目蛙科(Ranidae)动物为例，蛙类中参与获得性免疫的主要是来源于胸腺和脾脏的淋巴细胞，相较于鱼类，蛙类的淋巴细胞已有了进一步的分化，可以分为T淋巴细胞和B淋巴细胞。T淋巴细胞主要参与细胞免疫，蝌蚪期主要在脾脏中产生，成体中在外周血的分布明显高于胸腺、脾脏、肾脏和肝脏等器官归］，具有直接杀伤细胞、通过分泌细胞因子调节免疫反应的作用。B淋巴细胞参与体液免疫，胚胎及幼体时期主要在肾脏中形成，而后骨髓也参与形成，在抗原刺激下B淋巴细胞转化为浆细胞并产生特异性抗体参与免疫反应01。蛙类免疫系统的能力呈现出季节性变化，冬眠时淋巴器官与循环系统淋巴细胞的数量明显减少，且淋巴细胞的分裂和增殖能力减弱，对抗原的识别能力下降，免疫力减弱，随后随着气温的上升免疫能力逐渐增强口〕。获得性免疫的启动通过细胞免疫和体液免疫，过程涉及细胞增殖、基因的激活和蛋白质的合成等生理过 程，且需要预先接触抗原和一定的时间激活，所以获得性免疫相较于先天性免疫的速
578许晴等：Toll样受体信号通路在两栖类中的研究进展
度更慢，但具有更严格的特异性和针对性血］。
包括两栖类在内的低等脊椎动物虽然已经具备获得性免疫，但该获得性免疫涉及多种生物学过程，反应速度较慢，往往不足以迅速消灭病原体，先天性免疫则提供了更快速的免疫防御机制，在机体对于病原体的早期应答中发挥重要作用判。Zhao等沏对大蹊铃蟾(Bombina maxima)的血液和皮肤进行转录组测序，发现B maxima具有强大且健全的先天性免疫系统。黄丽［旳分析12种两栖动物免疫相关基因的表达情况结果显示两栖类先天性免疫基因数目要远远大于获得性免疫基因。一直以来，先天性免疫被认为是非专一性的识别病原微生物，但20世纪90年代模式识别受体(PRRs)Toll样受体的发现表明先天性免疫同样可以专一性的识别病原微生物O三字格成语
3Toll样受体(TLR)
"Toll"—词最初是指早期果蝇(Drosop加a)幼虫中控制背腹方向的细胞表面受体1如，随后Lemaitre 等妙］发现Toll在果蝇成体中发挥有效的抗真菌反应; 1991年，Gay等⑶］在哺乳动物中发现IL-1受体的胞质部分与果蝇Toll蛋白结构具有同源性，提示Toll可能具备的免疫学功能；1996年，Hoffman发现果
蝇受到病原微生物的侵袭时，Toll信号通路会被激活并参与调节免疫基因的表达⑶1;1997年，Medzhitov等皿发现了与果蝇Toll受体同源的Toll样受体4，并将类似于Toll蛋白的受体命名为Toll样受体，即TLR。TLRs在各种脊椎动物中的数量因类的不同而不同。目前，TLRs在哺乳动物中的研究最为广泛，在哺乳动物中至少已经发现13种坯基因，分别被命名为tlrl-tlrl3，其中人类基因组中已鉴别出tlrl-tlrlO10种册基因，小鼠中鉴别出除tlrlO之外的tlrl-tlrl3中的12种基因，其中tlrl1-tlrl3为小鼠特＜［33］；在鱼类中共发现23种，鸟类中发现10种。对于两栖类和爬行类汾家族成员的研究还比较少，除了发现与哺乳动物册基因的直系同源物，目前只在两栖类非洲爪蟾(Xenopus2ae诚)和部分爬行动物中发现tlrl4基因，在非洲爪蟾中还发现了tlrl6基因⑶］。
TLRs属于I型跨膜蛋白，由富含亮氨酸重复序列胞外域(LRRs)、跨膜区域和包内的TIR结构域3部分组成。TLRs广泛表达于各类免疫细胞，如单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、NK细胞等〔旳。当机体遭到病原体的侵袭时，TLRs可刺激这些天然免疫细胞分泌大量细胞因子、趋化因子等调节感染部位免疫细胞的迁移，诱导炎症反应的发生，同时促进与吞噬相关的基因(胚4CR。、SR-A、CD36、LOX-1等)的表达，增强巨噬细胞、中性粒细胞的吞噬能力，从而增强对病原体的清除能力3〕。此外，TLRs也大量表达于上皮和内皮细胞，如呼吸道、肠上皮、血管内皮和泌尿道生殖上皮等先天性免疫的第一道防线。对病原体的先天性免疫启动的一个关键因素是识别病原体上常见的、宿主体内通常不存在的成分，即病原相关分子模式(PAMPs)，主要包括脂多糖(LPS)、病毒双链RNA(dsRNA)、肽聚糖(PGN)
、酵母多糖、脂磷壁酸(LTA)和细菌DNA等泅。TLRs可通过胞外的LRRs 结构来识别不同的PAMPs，被激活后的TLRs通过胞内的TIR结构域和含有相同结构域的接头蛋白相互作用，激活下游信号。
TLR s信号通路可以分为MyD88介导的信号通路和非MyD88介导的信号通路。以哺乳动物TLRs信号通路为例，TLR1、2、5、6、7、9、11、12由MyD88介导的信号通路转导，TLR3由非MyD88介导的信号通路转导，TLRs可由MyD88介导也可不依赖MyD88介导(图l)［37］o在MyD88介导的信号通路中，活化的MyD88募集IRAKs，然后与接头分子肿瘤坏死因子受体相关因子TRAF6形成转导复合体，激活的TRAF6进一步激活I k B激酶，活化的I k B激酶磷酸化I k B，释放重要的核转录因子NF-k B,NF-k B在其核定位信号序列的引导下进入到细胞核内，结合到靶基因的启动子上启动靶基因的转录表达，最终释放炎性因子完成免疫应答。在MyD88非依赖途径中，TLR3和TLR4识别配体后以TRIF作为接头分子，所以该途径又称为TRIF依赖途径，TLRs与TRIF结合后招募并激活TRAF6或TRAF3，促使IRF3、IRF7二聚体以及NF-K B激活并进入细胞核内，启动靶基因的转录⑶］。
TLR s不仅在先天性免疫中起到识别病原激活天然免疫细胞、诱导免疫细胞向感染部位迁移、激活下游免疫级联反应诱导一系列炎性介质的产生等作用，对获得性免疫也起到重要的调控作用，是沟通先天性免疫和获得性免疫的桥梁刚。首先，TLRs可激活T 淋巴细胞和B淋巴细胞，在启动获得性免疫中发挥作用。研究发现，DCs是最有效的抗原呈递细胞(APC)，未成熟的DCs咼表达与吞噬相关的受体，摄取和加工处理抗原的能力较强，而成熟的DCs提供的共刺激信号协同抗原刺激信号在淋巴细胞
的激活中起
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重要作用，由微生物引起的DCs 的成熟需要TLRs 的 参与，TLRs 识别配体后促使DCs 成熟并高表达共刺
激分子（CD40、CD80、CD86等），同时上调IL-6等
因子的表达来抑制调节性T 细胞的活性⑷〕，进而迁
移至淋巴器官介导T 淋巴细胞的激活［41-42\除表面 共刺激分子外，TLR s 激活后DCs 释放的促炎性细胞
因子（TNF-a 、IL-1、IL-6, IL-12等）和趋化因子
（VCAM 等）均增加，这些变化不仅可以招募中性粒细
胞、巨噬细胞等先天性免疫细胞聚集至感染部位，还 可以诱导适应性免疫的，所以DCs 也是TLRs 连
接先
天免疫与获得性免疫的纽带细胞。B 细胞的激活同样 需要TLRs 的参与，Pasare 等则的研究发现B 细胞表
达T 细胞依赖型抗体不仅需要激活CD4 + T 细胞，还 需要TLRs 激活B 细胞。其次在T 细胞分化过程中，
TLR s 可参与调节Thl/Th2细胞间的平衡，并在机体 初次免疫时记忆性T 细胞的分化中发挥作用。抗原刺
激活化后的DCs 可分泌不同细胞因子促使T 细胞分化都市艳情
为Thl 、Th2等效应细胞，TLRs 是决定DCs 分泌细胞
因子类型的重要因素之一，例如TLR9与配体结合可促
使DCs 分泌Thl 型细胞因子（IL-12、IFN-7等），TLR2
与配体结合可促使DCs 分泌Th2型细胞因子（IL4等）， 分别诱导T 细胞向不同方向分化泗。机体T 细胞向记
忆T 细胞的分化过程也需要TLRs 的参与，机体初次启
动对某种抗原的免疫应答时，T 细胞会分化成为记忆性
T 细胞和效应T 细胞，Pasare 等⑷］的研究发现MyD88
基因缺陷型小鼠在初次受到脂多糖刺激时，尽管暂时 抑制调节性T 细胞可以恢复T 细胞的免疫应答，但无
法形成记忆性T 细胞，表明记忆性T 细胞的形成可能
需要TLRs 介导的信号参与。此外，TLRs 还可诱导DCs
产生 I 型干扰素（IFN-a 、IFN-B 、IFN-s 和 IFN-X ）, I 型干扰素在抗病毒方面发挥重要作用，同时在促进获 得性免疫中也起到重要作用卩句O
Cell membrane
TLR2TLR1/6TLR4
Endosome
IRAK4
CD14
TKK r
Nucleus
IL-6,IL-8
Ccmple:;x
智能材料TLR 3
图1 TLR 信号通路⑶］
Fig. 1 TLR signaling pathways ⑶］
TLR5/11/12TLR7 TLR8 TLR9
MyD88
更A
巧
TRAF6
NF- k B
Comple
MyD88
IRAKI
IRAK4
IRAK4
MyD88
棒棒tv
TRAF6
MAP Kinase
I k B
I Ccmplex NF-k B
IL-6,IL-8,IL-12,
TNFa
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z
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