The Expression and significance of Toll Like Receptor 2 on Peripheral Blood Monocytes and the Levels of interleukin
17 in Serum of Patients with rheumatoid arthritis
Abstract
Background Rheumatoid arthritis(RA) is a systemic autoimmune disease which etiopathogenesis remains poorly understood. Numerous investigations have provided that infection and overproduction of cytokines are contributed to the etiopathogenesis of RA. Toll-like receptors (TLRs), as a group of pattern-recognition receptors, become a bridge to link innate immune and adaptive immune. Further understanding of the role of TLRs and some cytokines（such as IL-17 and TNF-α）in pathological autoreactivity of the adaptive immune system will likely lead to important insights into the etiopathogenesis of RA and potential targets for novel therapies.
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Objective: To study the expression of toll like receptor 2 (TLR-2) on peripheral blood monocytes and interleukin 6 (IL-6) 、interleukin 17(IL-17) 、tumor necrosis factor α,（TNF-α）levels in serum of patients with rheumatoid arthritis (RA ), As well as with the clinical, laboratory examination of the relationship and to discuss the potential mechanism.
Methods:The expression of TLR-2 on peripheral blood monocytes of 50 RA patients(30 in active stage and 20 in inactive stage) and 30 health controls were determined by flow cytometry, the serum levels of IL-6、IL-17 and TNF-αwere determined by ELISA in each group. the correlation between TLR2 expressions、levels and clinical measures were analyzed.
Results:
1) Compared to RA patients and healthy controls, the expression of TLR2 on PBMCs of patients active stage significantly increased(P<0.01). There was no dispariation between inactive and active patients(P>0.05)
2)The serum levels of IL-6、IL-17、TNF-a in active RA patients was significantly higher than the inactive patients (P<0.01)，and higher than the health controls (P<0.01). There was no dispariation between the inactive patients and the health controls.
3) The expression of TLR-2 on peripheral blood monocytes 、IL-6、IL-17、TNF-a levels in the serum of active patients were positively correlated with ESR and CRP.
4）MFI、the expression of TLR-2 on peripheral blood monocytes in patients with RA were positively correlated to IL-6、IL-17、TNF-a levels in the serum. Conclusions:
1)The expression of TLR-2 on peripheral blood monocytes of RA patients increased significantly.
2)The increase of IL-6、IL-17、TNF-a levels of active RA patients may be corre- lative with the high expression of TLR2.武英高速公路
3)TLR2 play a role in occurrence of RA by up-regulating IL-6、IL-17、TNF-a. Key words：Arthritis, Aheumatoid，Toll-like receptor，Interleukin
前言
类风湿关节炎( rheumatoid arthritis, RA)是一种慢性对称性多关节炎症为主要表现的系统性自身免疫性疾病，主要病变部位在关节滑膜，其次为浆膜、心、肺、动脉、神经、眼等结缔组织等[ 1 ]，侵犯多个关节，常以手足小关节起病，多呈对称性，主要病理变化是：关节滑膜衬里层细胞大量增生，滑膜血管翳的侵蚀导致关节结构的破坏和功能丧失，病变不局限在关节，可累及多器官、多系统。 泰晤士报高等教育副刊
RA的病因尚不清楚，多年来一直是人们研究的热点。大多数学者认为，RA 的发病主要与感染因子、自身免疫、遗传因素和环境有关，有资料表明病毒、细菌等感染因素可能是疾病的触发因子，诱发全身免疫系统的紊乱，体内和关节中产生大量细胞因子和血清中生成众多自身抗体。
1980年德国生物学家Nüsslein V olhard[2]在研究黑腹果蝇的胚胎发育发生变化, 发现一种具有杂合子
致死性突变的雌性果蝇所产生的卵不能孵化，观察这种果蝇胚胎表皮特点时，她们非常惊讶，因而脱口说出―Ｔoll ”，相当于―crazy‖的意思，首次有了“Toll”这一概念，它可介导真菌和革兰阳性细菌对果蝇的感染免疫反应。随后在哺乳动物中发现了相似的蛋白，可识别外源性微生物，启动先天性免疫反应，清除侵入的病原微生物，命名为Toll样受体(toll like receptor，TLR), 1997年Medzhitov 等[3]率先报道了人类的TLR，TLR是一类重要模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，参与识别多种非特异性的、保守的微生物组分以及相应内源性配体。它们不仅在天然免疫中具有重要作用，也是联系天然免疫与特异性免疫的桥梁，从多个方面影响特异性免疫应答，在包括RA在内的慢性免疫性炎症疾病的发生发展中扮演着重要角。陆续有11 种Toll 的同源物相继被鉴定( TLR 1～TLR 11) ,TLR 2是TLR家族中的一个重要成员，它属于PRR，通过对病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMP)进行识别、结合，并引发一系列信号转导，进而导致细胞因子明显增多，细胞因子网络失调与RA的发病密切相关，其中白细胞介素-17(interleukin-17，IL-17)异常表达和失调可能作为RA发病机制中的重要因素。IL-17是近来一研究热点，在RA病程中发挥重要作用，可以诱导RA患者关节滑液中多种致炎因子的产生。TLR2识别病原微生物及其产物的结构基础为胞外段结构域[4]，在所有的TLR中,TLR2 识别的配体可能最多。其外源性配体主要来自病原微生物，是微生物进化过程中的保守成分，如细菌的脂多糖、胞壁酸、肽聚
糖以及细菌和病毒的核酸等。内源性配体来自宿主细胞，如热休克蛋白、细胞外基质降解成分等，内
源性配体在机体应激或是组织损伤时. TLR2的胞内信号转导途径至少有两条，一是髓样分化蛋白MyD88依赖途径。即活化的TLR2的胞内TIR结构域与MyD88羧基端相互作用而使后者活化。MyD88连接TLR到IL受体相关激酶家族成员，包括IL受体相关激酶1 和IL受体相关激酶4，进而激活肿瘤坏死因子a (tumor necrosis factor- a, TNF- a)受体相关因子6。活化后的TNF-α受体相关因子6 通过转化生长因子β活化激酶1 和核因子-κB ( nuclear factor-kappa B, NF-κB)抑制蛋白激酶信号级联，使NF-κB抑制蛋白磷酸化而降解，最终使MyD88的核定位信号暴露, 促使NF-κB 转迁到核内, 激活相应基因的转录。MyD88 依赖通路也是所有TLR共用的，是包括细胞因子产物在内的一系列核心反应。但是也有研究证明，除了MyD88依赖通路的核心反应外，尚有依赖于微生物产物的性质而诱导的另一种信号转导通路[5]。目前，已经得到鉴定的含有TIR结构域的非MyD88转接蛋白有3 种，分别为TIRAP /MyD88衔接蛋白、TRIF /TICAM-1以及TICAM-2 /TRAM蛋白。其中MyD88衔接蛋白又称TIRAP ( TIR-domian containing adator protein) ，它则在TLR2 介导的信号通路中起作用, 介导了TLR2非MyD88 依赖的通路[6,7]。TLR2调节参与RA的关键细胞的功能：PAMP通过激活免疫细胞和／或滑膜细胞，触发了促炎细胞因子如IL-1、IL-6、IL-8、TNF-a 以及趋化因子如CCL2、CCL18、CXCL8、CXCL-16、RANTES等的分泌，从而参与RA的发生和发展。
众多研究表明：造成RA 慢性炎症和关节骨破坏的原因十分复杂，与众多的细胞因子有关[8]。其中IL-6、IL-17、TNF-a参与RA发病的整个过程，造成关节滑膜、软骨的侵蚀破坏，RA与TLRs、IL-6、IL-17、TNF-a之间关系已成为学者关注热点之一。
穆斯塔法
本文应用流式细胞术及酶联免疫吸附方法分别检测RA和正常人TLR、IL-6、
IL-17、TNF-a中的表达，探讨其在RA发病机制中可能的作用。
对象与方法
研究对象
1、患者组
选择2008年5月至2009年1月于蚌埠医学院第一附属医院风湿免疫科就诊的RA患者，其中活动期30例, 女性25例, 男性5例，年龄25-60岁，稳定期20例，女性15例，男性5例，平均年龄为45.7±10.4岁，所有患者均符合1987年美国风湿病协会（ACR）制定的分类标准。病情活动程度的评分参照类风湿关节炎疾病活动性指数评分(disease active score,DSA) , 包括28个关节, DSA28≥2.68为活动期, 且半年内未使用激素、免疫抑制剂及生物制剂；DSA28＜2.68为疾病稳定期。
2、正常对照组
正常人30例，女性25例，男性5例，平均年龄40.17±10.50岁均来自年龄和性别匹配的健康体检者，排除自身免疫病及其他疾病。两组性别、年龄均衡，无统计学差异。
研究方法
带锈防锈剂
1、实验所用仪器：
低温离心机Eppeedorf5810R 美国
台式高速离心机TGL-18R 中国
ELISA实验所需仪器：
Bio-Rad 680型酶标仪美国伯乐公司微粒体
电热恒温干燥箱上海一恒科技有限公司
隔水恒温培养箱上海一恒科技有限公司
加样移液器、加样头以及试管等消耗性材料、磁力搅拌器等
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