简并PCR与一般PCR的不同之处在于,一般PCR中的引物是用给定的核苷酸序列设计的两条特定的引物,而在简并PCR中用的是由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库。其基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库,从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因。简并引物库是由一组引物构成的,这些引物有很多相同碱基,在序列的好几个位置也有很多不同的碱基,只有这样才会和多种同源序列发生退火,以实现PCR扩增[ 14, 15 ] 。 3. 2 简并PCR的方法
邵东新发现引物设计是简并PCR的关键环节,设计引物之前,最好画出要扩增基因所在基因家族所有成员的对比图,标出保守的氨基酸残基,并标记出编码每个氨基酸的密码数目,设计简并PCR引物所需要的两个必要条件:一是两段保守的氨基酸序列或DNA序列,保守氨基酸区段最好不要以丝氨酸、精氨酸和亮氨酸为主;二是蛋白质N端序列已知。一般简并性1 000～10 000倍之间较好,引物位点最好在编码最保守氨基酸的密码子序列上,用次黄嘌呤作为中和碱基,在同一个位置分别使用多个寡聚核苷酸引物库,在引物的末端要用密码子的共同碱基序列,用特定的密码子编码某些氨基酸。简并PCR的引物可用计算机软件设计,常用的软件有: Primo Degenerate
3. 4、Genefisher、CODEHOP和Simp le degenerate p rimer (U: Oregon)。
合肥市小学学业评价大有前途下载简并PCR的引物设计应遵循的几个原则[ 16 ] :考虑所选靶扩增区的进化保守性和简并PCR的扩增特异性,选择同源性高且简并性低的氨基酸区域;选择使用率最高的密码子,进一步限定引物的简并度;引物的3′端不应存在简并,因为单碱基错配会阻碍延伸;在一些多义位置使用能与多种成分配合的脱氧次黄苷以降低简并度;引物的长度可短到对应4～6个氨基酸的长度,一般为15～20个核苷酸。模板的选择:用基因组DNA作模板的优点是待扩增基因家族的各个成员是等量存在的,并且基因组DNA比较容易获得。缺点是存在内含子,不仅会隔断引物与模板的配对,也会导致扩增产物太长不能有效扩增。cDNA尽管很难获得,但用作模板最大好处是可以预期扩增产物的大小,可以在不同大小的PCR产物中挑取所需要的PCR产物,需要注意的是:以cDNA为模板得到的正确大小的电泳带很可能是许多基因家族成员复杂的混合物,因此,在分析由这些PCR产物产生的转化克隆时必须分析很多个克隆,才可能到所需要的基因成员。引物浓度不要大于1μmol/L, 0. 2μmol/L的浓度已经足够了。二甲基亚砜对于扩增大于1kb的产物有好处,聚乙二醇有利于低含量模板DNA的PCsR扩增。应用简并PCR获得全长基因的方法:一种是采用简并PCR扩增的cDNA小片段作为探针筛选cDNA文库,从而获得相应的目的基因;另一种方法是以此小片段为基础设计特异引物进行3′和5′cDN
帕蒂尼
A末端快速扩增(Rap id Amp lification cDNA Ends, RACE) ,扩增此cDNA的其余部分,从而获得全长基因[ 16 ] 。
3. 3 简并PCR的应用
氧化锡
在发现新基因或基因家族方面是一个非常好的方法,大多数基因都是以基因家族的形式出现,而以基因家族出现的基因往往具有一定的相似性,通过比较很多同源蛋白的蛋白序列,就会到蛋白质的保守序列和可变序列,根据这些信息,就可以到进行PCR的基因序列,就会发现新基因[ 17 ] 。简并PCR还可用于基因表达的检测、病毒的检测、基因组研究等[ 18 ] 。
师生关系总之,随着时间的推移, PCR技术将更加广泛地应用于分子生物学、遗传学、医学、微生物学等研究领域, PCR技术将更加科学、更加完美和实用。
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