纳米氧化锌经口染毒对Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠外周脏器的影响 韩 洁１，２，田 蕾２，刘子怡１，２，方 振１，３，袭著革２△，刘晓华１，２△
（１．天津体育学院，天津３０１６１７；２．军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所，天津３０００５０；
３．滨州医学院，山东烟台２６４０００）搜索引擎研究
【摘要】 目的：探讨纳米氧化锌经口染毒６０ｄ对Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠多种外周脏器的损伤作用。方法：２０只雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为对照组和实验组，每组１０只，实验组将纳米氧化锌溶液以２０ｍｇ／ｋｇ体重的剂量连续灌胃染毒６０ｄ，对照组给予相应量的生理盐水；小鼠每周称重一次，染毒结束后，眼球取血，检测血糖、血脂、肝功能和肾功能相关指标，以及血清中炎症因子ＰＡＦ、ＩＬ ６和ＴＮＦ α含量；取心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏和小肠组织制备病理切片，ＨＥ染后，观察组织形态学变化。结果：实验组和对照组之间的体重无显著性差异；与正常对照组比较，实验组大鼠血中白蛋白（ＡＬＢ）、白蛋白／球蛋白比值（Ａ／Ｇ）、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）、谷草／谷丙转氨酶比值（Ｓ／Ｌ）、尿酸（ＵＡ）和尿素氮（ＢＵＮ）含量明显升高（Ｐ＜０．０５或Ｐ＜０．０１）；两组间血清中炎症因子含量无显著差异。病理学检查发现，实验组心肌中部分区域出现浊肿，肝脏出现轻度炎性病变（灶性或小灶性坏死），脾脏素沉着减少，肺部出现 轻或中度间质性炎症，肾脏和小肠未见明显病理改变。结论：纳米氧化锌经口染毒６０ｄ未引起Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠血液系统炎症，但可诱导心脏、肝脏、脾脏和肺脏出现轻度的病理变化，并导致肝脏和肾脏的功能异常。
【关键词】纳米氧化锌；小鼠；毒性；器官
【中图分类号】Ｒ１１４ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０１９）０６ ５５５ ００６
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５８５９．２０１９．１２２
Ｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒａｌｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｚｉｎｃｏｘｉｄｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｎｔｈｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ
ｏｒｇａｎｓｏｆＣ５７ＢＬ／６Ｊｍｉｃｅ
ＨＡＮＪｉｅ１，２，ＴＩＡＮＬｅｉ２，ＬＩＵＺｉ ｙｉ１，２，ＦＡＮＧＺｈｅｎ１，３，ＸＩＺｈｕ ｇｅ２△，ＬＩＵＸｉａｏ ｈｕａ１，２△（１．ＴｉａｎｊｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＰｈｙｓｉｃａｌＥｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０１６１７；２．ＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＥｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌＭｅｄｉｃｉｎｅａｎｄＯｐｅｒａｔｉｏｎａｌＭｅｄｉｃｉｎｅ，
ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００５０；３．ＢｉｎｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｙａｎｔａｉ２６４０００，Ｃｈｉｎａ）
【ＡＢＳＴＲＡＣＴ】Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｏｒａｌｅｘｐｏｓｕｒｅｏｆｚｉｎｃｏｘｉｄｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｎｍｕｌｔｉｐｌｅｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｏｒｇａｎｓｏｆＣ５７ＢＬ／６Ｊｍｉｃｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｗｅｎｔｙｍａｌｅＣ５７ＢＬ／６Ｊｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ，ｗｉｔｈ１０ｍｉｃｅｉｎｅａｃｈｇｒｏｕｐ．Ｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗａｓｔｒｅａｔｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｇａｖａｇｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｚｉｎｃｏｘｉｄｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｌｕｔｉｏｎａｔａｄｏｓｅｏｆ２０ｍｇ／ｋｇｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｆｏｒ６０ｄａｙｓ，ａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｗａｓｇｉｖｅｎｔｈｅｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｍｏｕｎｔｏｆｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ；ｔｈｅｍｉｃｅｗｅｒｅｗｅｉｇｈｅｄｏｎｃｅａｗｅｅｋ．Ａｆｔｅｒｔｈｅｅｎｄｏｆｔｈｅｅｘｐｏｓｕｒｅ，ｂｌｏｏｄｓａｍｐｌｅｓｗａｓｃｏｌｌｅｃｔｅｄｆｒｏｍｔｈｅｅｙｅｂａｌｌｓ，ａｎｄｔｈｅｌｅｖｅｌｓｏｆｂｌｏｏｄｓｕｇａｒａｎｄｌｉｐｉｄｓ，ｌｉｖｅｒａｎｄｋｉｄｎｅｙｆｕｎｃｔｉｏ
ｎ，ａｎｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓｓｕｃｈａｓｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ（ＰＡＦ），ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６（ＩＬ ６）ａｎｄｔｕｍｏｒｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ（ＴＮＦ α）ｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｔｈｅｎ，ｔｉｓｓｕｅｓｓｅｃｔｉｏｎｓｏｆｔｈｅｈｅａｒｔ，ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎ，ｌｕｎｇ，ｋｉｄｎｅｙａｎｄｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄａｎｄｔｈｅｉｒｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｗｅｒｅｏｂｓｅｒｖｅｄａｆｔｅｒｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ ｅｏｓｉｎｓｔａｉｎｉｎｇ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｉｎｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔｂｅｔｗｅｅｎｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐａｎｄｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐ．Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ｔｈｅｓｅｒｕｍｌｅｖｅｌｓｏｆａｌｂｕｍｉｎ（ＡＬＢ），ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎｒａｔｉｏ（Ａ／Ｇ），ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＡＬＰ）ａｃｔｉｖｉｔｙ，ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ／ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｒａｔｉｏ（ＡＳＴ／ＡＬＴ），ｕ ｒｉｃａｃｉｄ（ＵＡ）ａｎｄｂｌｏｏｄｕｒｅａｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｇｒｏｕｐｗｅｒｅｉｎｃｒｅａｓｅｄｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５ｏｒＰ＜０．０１）．Ｔｈｅｒｅｗａｓｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅｉｎｓｅｒｕｍｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓ．Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎｓｈｏｗｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｕｒｂｉｄｉｔｙ，ｍｉｌｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒ
ｙｌｅｓｉｏｎｓ（ｆｏｃａｌｏｒｓｍａｌｌｎｅｃｒｏｓｉｓ）ｉｎｌｉｖｅｒ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎｉｎｓｐｌｅｅｎ，ｍｉｌｄｏｒｍｏｄｅｒａｔｅｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｌｕｎｇｓ，ａｎｄｎｏｏｂｖｉｏｕｓｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｋｉｄｎｅｙｓｏｒｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳｉｘｔｙｄａｙｓｏｆｏｒａｌｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏｎａｎｏｍｅｔｅｒｚｉｎｃｏｘｉｄｅｄｉｄｎｏｔｃａｕｓｅｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｂｌｏｏｄｓｙｓｔｅｍｏｆＣ５７ＢＬ／６Ｊｍｉｃｅ，ｂｕｔｉｔｃｏｕｌｄｉｎｄｕｃｅｍｉｌｄｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｎｇｅｓｉｎｔｈｅｈｅａｒｔ，ｌｉｖｅｒ，ｓｐｌｅｅｎａｎｄｌｕｎｇｓ，ａｎｄｌｅａｄｔｏａｂｎｏｒｍａｌｌｉｖｅｒａｎｄｋｉｄｎｅｙｆｕｎｃｔｉｏｎ．
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】 ｚｉｎｃｏｘｉｄｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ； ｍｏｕｓｅ； ｔｏｘｉｃｉｔｙ； ｏｒｇａｎ
【基金项目】军队重点项目（ＢＷＳ１７Ｊ０２５，ＡＳＷ１６Ｊ００４，ＢＥＰ１６Ｊ００１）【收稿日期】２０１９ ０４ ０４【修回日期】２０１９ １１ ０５
△【通讯作者】Ｔｅｌ：１３１１６１４０６８２，１３６８２１１７７６０；Ｅ ｍａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｏ ｈｕａ１９９２＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ，ｚｈｕｇｅｘｉ２００３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ 纳
米材料由于其体积小、比表面积大，逐渐渗透于人们生活和生产的各个方面。纳米氧化锌颗粒（ｚｉｎｃｏｘｉｄｅｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，ＺｎＯＮＰｓ）是一种新型的金属氧化物纳米颗粒，一方面由于其高效的紫外线吸
５
５
５
中国应用生理学杂志，２０１９，３５（６）
收性能，被广泛应用于化妆品和防晒霜中，另一方面由于具有抗菌特性，被用于食品工业添加剂和食品包装，另外，它们还被用于农业杀菌剂以及抗癌药物等生物医学领域［１］。ＺｎＯＮＰｓ可通过食品、食品包装和药物载体直接进入人体，也可能通过食物链使泄露于环境中的ＺｎＯＮＰｓ被人体摄入。此外，一些通过呼吸进入人体的纳米颗粒还可以经肺黏膜纤毛系统排出后，被吞入胃肠道［２］。通过胃肠道途径进入机体的ＺｎＯＮＰｓ会对人体产生哪些损伤效应，成为科研工作者不得不考虑的问题。Ｅｓｍａｅｉｌｌｏｕ［３］等报道ＺｎＯＮＰｓ暴露５ｄ可损伤肝，肾和肺。Ｈｏｎｇ［４］等报道ＺｎＯＮＰｓ可诱导肝脏组织损伤。Ｋｉｍ［５］等报道口服不同大小粒径的Ｚｎ
ＯＮＰｓ１４ｄ可在体内和体外诱导免疫毒性。目前，关于ＺｎＯＮＰｓ经口灌胃暴露的毒性效应研究已有报道，但是这些研究要么使用较高浓度的纳米氧化锌，要么暴露时间较短，并没有低浓度长期暴露的研究结果。本文主要探讨食品或包装中的纳米氧化锌对机体的毒性，因此，选择使用浓度较低的ＺｎＯＮＰｓ，及６０ｄ的暴露时间，分析其毒性靶器官，为今后食品行业使用ＺｎＯＮＰｓ的用量提供科学依据。
１ 材料与方法
１．１ 材料
ＺｎＯＮＰｓ，白粉末，其质量分数为９９．９％，颗粒形态不规则，粒径在２０～８０ｎｍ之间（西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司提供），在４℃下，经超声仪处理３０ｍｉｎ后，用生理盐水配置成２ｍｇ／ｍｌ的悬浮液。
血生化分析仪（Ｃ５０１，罗氏），连续可见光谱酶标仪（ｘＭａｒｋＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＳｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ，Ｂｉｏ Ｒａｄ），炎症因子ＰＡＦ，ＩＬ ６和ＴＮＦ α检测试剂盒酶联免疫吸附（ＥＬＩＳＡ）试剂盒（北京博奥拓达），１０％甲醛固定液、无水乙醇、二甲苯和苏木素 伊红（ＨＥ）染液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司）。
１．２ 实验动物分组及染毒
１０周龄雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。饲养于一个环境控制室里，温度保持在（２１±１）℃，湿度在５０％±５％，１２ｈ的光照／１２ｈ的黑暗循环，自由活动，普通饲料，正常饮食饮水，适应性饲养一周后纳入实验。
２０只雄性Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠随机分为两组，对照组和实验组，每组１０只，实验组将ＺｎＯＮＰｓ溶液以２０ｍｇ／ｋｇ体重的剂量连续灌胃染毒６０ｄ，根据小鼠体重灌胃体积为０．２～０．３ｍｌ，对照组除了使用生理盐水代替ＺｎＯＮＰｓ溶液外，其余条件均相同。１．３ 小鼠一般状况观察及体质量测定
灌胃后每日观察小鼠活动，饮食，皮毛，精神等状况并做详细的记录。灌胃期间每周称取体重，记录小鼠每周的体重变化。
１．４ 血液生化指标测定
实验结束后，小鼠经眼球取血，室温放置２０ｍｉｎ后，将血液以３０００ｒ／ｍｉｎ，４℃，离心１０ｍｉｎ，收集上清液，于 ８０℃冷冻保存。利用全自动生化分析仪测定血中总蛋白（ｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎ，ＴＰ）、白蛋白（ａｌｂｕｍｉｎ，ＡＬＢ）、球蛋白（ｇｌｏｂｕｌｉｎ，ＧＬＯＢ）、白蛋白／球蛋白比值（ａｌｂｕｍｉｎ／ｇｌｏｂｕｌｉｎｒａｔｉｏ，Ａ／Ｇ）、谷丙转氨酶（ａｌａ ｎｉｎｅｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＡＬＴ）、谷草转氨酶（ａｓｐａｒｔａｔｅｔ
ｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ，ＡＳＴ）、谷草／谷丙转氨酶比值（ａｓｐａｒ ｔａｔｅｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ／ａｌａｎｉｎｅｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅｒａｔｉｏ，ＡＳＴ／ＡＬＴ）、碱性磷酸酶（ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＡＬＰ）、尿素氮（ｂｌｏｏｄｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ，ＢＵＮ）、肌酐（ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ，Ｃｒｅａ）、尿酸（ｕｒｉｃａｃｉｄ，ＵＡ）、血糖（ｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅ，ＧＬＵ）、胆固醇（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ，ＣＨＯＬ）、甘油三酯（ｔｒｉ ｇｌｙｃｅｒｉｄｅ，ＴＧ）、高密度脂蛋白（ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏ ｔｅｉｎ，ＨＤＬ）、低密度脂蛋白（ｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ，ＬＤＬ）。
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１．５ 血清炎性因子测定
采用酶联免疫吸附法（ＥＬＩＳＡ）测定血清中ＰＡＦ、ＩＬ ６和ＴＮＦ α水平，按照试剂盒操作步骤，用酶标仪检测待测样品及标准品４５０ｎｍ处的ＯＤ值。根据ＯＤ值和浓度据绘制出标准曲线并计算各样本浓度。
１．６ 病理检查
将小鼠麻醉后取心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织，于４％的多聚甲醛溶液中固定，７２ｈ常规冲洗，脱水透明，石蜡包埋，４～６μｍ组织切片，６０～６５℃烤片，３０ｍｉｎ脱蜡，ＨＥ染，
封片，于光学显微镜下观察各组织的病理变化。
１．７ 统计学处理
实验结果数据采用均数±标准差（珋ｘ±ｓ）表达，采用ＳＰＳＳ２４．０统计软件进行分析，显著性差异用ｔ检验计算。
２ 结果
２．１ ＺｎＯＮＰｓ经口染毒对小鼠一般状况及体重的影响
对照组小鼠精神状况良好，饮食、活动情况均正常，皮毛光亮，ＺｎＯＮＰｓ灌胃６０ｄ后，小鼠出现活动减弱，行动迟缓，进食饮水略减，皮毛疏松无光泽。
６
５
５ＣｈｉｎＪＡｐｐｌＰｈｙｓｉｏｌ，２０１９，３５（６）
每周体重监测结果显示：实验组小鼠的体重与对照组比较无显著性差异（图１）
。
Ｆｉｇ．１ ＣｈａｎｇｅｓｏｆｂｏｄｙｗｅｉｇｈｔａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＺｎＯＮ
Ｐｓ（ｎ
＝１０）
２．２ ＺｎＯＮＰｓ经口染毒对小鼠血糖、血脂的影响
ＺｎＯＮＰｓ灌胃６０ｄ后，小鼠血糖水平较对照组有升高趋势，但无统计学差异，而血液中ＣＨＯＬ、ＴＧ、ＨＤＬ和ＬＤＬ含量呈现降低趋势，也无统计学差异（图２）
。
Ｆｉｇ．２ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｂｌｏｏｄｇｌｕｃｏｓｅａｎｄｂｌｏｏｄｌｉｐｉｄｓａｆｔｅｒｅｘｐｏ
ｓｕｒｅｔｏＺｎＯＮＰｓ
（ｎ＝１０）２．３ ＺｎＯＮＰｓ经口染毒对小鼠肝、肾功能的影响
ＺｎＯＮＰｓ灌胃６０ｄ后，染毒组血中ＡＬＢ含量、Ａ／Ｇ值、ＡＳＴ／ＡＬＴ值和ＡＬＰ活性显著高于对照组（Ｐ＜０．０５，Ｐ＜０．０１），ＡＳＴ活性呈现升高趋势，提示存在肝功能异常。而染毒组血中Ｕ
Ａ和ＢＵＮ含量显著高于对照组（
Ｐ＜０．０５和Ｐ＜０．０１），提示此暴露模型可导致小鼠肾功能异常（表１）。
２．４ ＺｎＯＮＰｓ经口染毒对血清炎症因子的影响
与对照组相比，ＺｎＯＮＰｓ暴露６０ｄ可导致小鼠血清中炎症因子ＰＡＦ、ＩＬ ６和ＴＮＦ α均呈现下降趋势，但均无统计学差异，表明经口染毒未引起小鼠出现系统性炎症反应（表２）。
２．５ ＺｎＯＮＰｓ经口染毒对各脏器组织结构的影响
心、肝、脾、肺、肾和小肠等组织切片经ＨＥ染后，利用光学显微镜观察病理变化。结果显示：对照组小鼠心肌细胞排列整齐，胞浆丰富，无变形或坏死，染毒组小鼠心肌部分区域出现浑浊肿胀，细胞核
溶解、形状不规律；对照组小鼠肝脏肝小叶结构清晰可见，肝细胞大小一致，排列有序，肝细胞无变性坏死，染毒组小鼠肝脏可见较轻的炎性病变，出现灶性或小灶性坏死，坏死的肝细胞有核溶解、核破裂及核浓缩的现象；对照组小鼠脾脏结构清晰，红髓及白髓比例正常，染毒组小鼠可见脾素沉着较少，脾脏红髓颜变淡，红髓白髓界限不清晰；对照组小鼠肺组织中肺泡结构清晰，肺泡上皮细胞无异型，无炎性改变，染毒组小鼠可见肺泡扩张不均匀，肺泡壁增厚，肺泡壁毛细血管扩张，充血，出现轻或中度间质性炎症；小鼠经ＺｎＯＮＰｓ染毒６０ｄ后，肾脏和小肠未见
明显的病理变化（图３见彩图页Ⅱ）。
Ｔａｂ．１ Ｃｈａｎｇｅｓｏｆｌｉｖｅｒａｎｄｋｉｄｎｅｙｉｎｄｅｘｅｓａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏ
ＺｎＯＮＰｓ（珋
ｘ±ｓ，ｎ＝１０）Ｉｎｄｅｘｅｓ
Ｃｏｎｔｒｏｌ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
ＴＰ（ｇ／Ｌ）５９．８０±４．２８６０．０８±４．１４
ＡＬＢ（ｇ／Ｌ）２１．７２±１．８４２５．２８±２．２２
ＧＬＢ（ｇ／Ｌ）３８．０８±３．５９３４．８０±２．７３
Ａ／Ｇ０．５６±０．０３０．７４±０．０５
ＡＬＴ（Ｕ／Ｌ）５３．２５±２５．９１４４．６０±６．６９ＡＳＴ（Ｕ／Ｌ）９７．７５±３５．９８１１９．２０±４０．４６
ＡＳＴ／ＡＬＴ１．７２±０．４３２．６３±０．６２
ＡＬＰ（Ｕ／Ｌ）１０８．８０±２８．１０１５６．４０±２５．１８
ＢＵＮ（μｍｏｌ／Ｌ）５．５６±１．１６８．３６±１．１７
Ｃｒｅａ（μｍｏｌ／Ｌ）９．２０±０．８４９．００±２．００
ＵＡ（μ
ｍｏｌ／Ｌ）５９．００±１０．１０
１５２．００±５２．１８
ＴＰ：ＴｏｔａｌＰｒｏｔｅｉｎ；ＡＬＢ：Ａｌｂｕｍｉｎ；ＧＬＢ：Ｇｌｏｂｕｌｉｎ；Ａ／Ｇ：Ａｌｂｕｍｉｎ／Ｇｌｏｂｕｌｉｎ；ＡＬＴ：Ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ：Ａｓ ｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＳＴ／ＡＬＴ：Ａｓｐａｒｔａｔｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓ
丹阳地震
ｆｅｒａｓｅ／Ａｌａｎｉｎｅａｍｉｎｏｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ；ＡＬＰ：Ａｌｋａｌｉｎｅｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ；ＢＵＮ：Ｂｌｏｏｄｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃｒｅａ：Ｃｒｅａｔｉｎｉｎｅ；ＵＡ：Ｕｒｉｃａｃｉｄ
Ｐ＜０．０５，安顺学院图书馆
Ｐ＜０．０１ｖｓｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ
Ｔａｂ．２ ＣｈａｎｇｅｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｆａｃｔｏｒｓａｆｔｅｒｅｘｐｏｓｕｒｅｔｏＺｎＯ
ＮＰｓ（ｐｇ／ｍｌ，珋
ｘ±ｓ，ｎ＝１０）ＧｒｏｕｐＰＡＦ ＩＬ－６
ＴＮＦ α
Ｃｏｎｔｒｏｌ２．１２±０．６２１１５．５４±２９．４８１１１．５７±３５．１３Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ１．９２±０．３３
１０５．７３±３５．４６
９７．１８±５１．３３
ＰＡＦ：Ｐｌａｔｅｌｅｔａｃｔｉｖａｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ；ＩＬ ６：Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ ６；ＴＮＦ α：Ｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃｔｏｒ α
３ 讨论
越来越多的研究表明，纳米颗粒可对肝脏、肾脏
和脾脏等组织产生毒性作用［６］
。纳米氧化锌作为
一种被广泛使用的纳米颗粒物，已证实对多种细胞，
如人肺上皮细胞［７］、胚胎肺成纤维细胞［８］和支气管上皮细胞［
９］
等产生损伤作用。鉴于ＺｎＯＮＰｓ在化妆品、食品工业和生物医药领域的应用，其经胃肠途径进入机体产生的毒性效应成为必须关注的问题。目前，关于ＺｎＯＮＰｓ经口暴露的毒性评价研究尚未
７
５５中国应用生理学杂志，２０１９，３５（６）
广泛开展，现有的研究存在纳米氧化锌使用浓度较高，或暴露时间较短的问题，缺乏低浓度、长期暴露的毒性评价结果。因此，本文选择将ＺｎＯＮＰｓ以灌胃方式，采用２０ｍｇ／ｋｇ体重的染毒剂
量和６０ｄ染毒时间，观察经口染毒对小鼠外周脏器的影响。
染毒组灌胃６０ｄ后，小鼠出现活动减弱，行动迟缓，进食饮水略减，皮毛疏松无光泽。李慧民［１０］等研究发现，４０、８０／１６０ｍｇ／ｋｇ连续灌胃９０ｄ可导致染毒组小鼠活动较少，有个别小鼠出现弓背、竖毛并出现死亡现象，其可能与过量的纳米粒子进入中枢神经系统引发神经细胞毒性有关，其作用机理还需进一步研究。据美国卫生部报道，在人体内，摄入高水平的锌几个月会降低ＨＤＬ胆固醇的水平，本实验中ＣＨＯＬ、ＴＧ、ＨＤＬ和ＬＤＬ含量均下降，但都无显著性变化，Ｋｉｍ［１１］等研究表明，１００ｎｍＺｎＯＮＰｓ经口染毒９０ｄ，５００ｍｇ／ｋｇ剂量可导致大鼠血糖和血清ＴＧ、ＴＣ显著降低，可能是本实验ＺｎＯＮＰｓ浓度低尚未引起小鼠脂质代谢失衡。此外，通过对血清炎症因子ＰＡＦ、ＩＬ ６和ＴＮＦ α的测定来评价ＺｎＯＮＰｓ的免疫毒性，发现都有下降的趋势，但是并无显著性差异，ＡｎｓａｒＳ［１２］等研究发现，６００ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ连续灌胃７ｄ可导致ＩＬ １β、ＩＬ ６和ＴＮＦ α含量显著上升，低剂量ＺｎＯＮＰｓ慢性口服暴露可能不会引起免疫毒性。
Ｂｅｎ Ｓｌａｍａ［１３］等研究发现，１０ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ连续灌胃５ｄ可导致雄性大鼠ＡＳＴ和ＡＬＴ活性显著升高。Ａｂｂａｓａｌｉｐｏｕｒｋａｂｉｒ［１４］等研究发现，每日腹腔注射５０、１００／１５０、和２００ｍｇ／ｋｇＺｎＯ１０ｄ可显著增加ＡＳＴ活性，注射１５０和２００ｍｇ／ｋｇＺｎＯ１０ｄ可显著增加ＡＬＴ活性。在本实验中，染毒组血中ＡＳＴ活性具
有升高趋势，尽管与对照组相比差异无显著性，但结合ＡＳＴ／ＡＬＴ的比值以及ＡＬＰ活性显著升高，提示存在肝功能异常，Ａｌｍａｎｓｏｕｒ［１５］等研究发现，２ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ腹腔注射２１ｄ可导致肝组织出现炎症，水肿变性等现象，本实验在肝脏中发现炎症病变等病理变化也证实存在局部肝损伤，但本研究中采用的染毒方式并未诱导严重的肝损伤和肝功能紊乱。Ｋｏｎｇ［１６］等研究也发现，４０ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ经口染毒９０ｄ可导致小鼠血中ＡＳＴ和ＡＬＴ活性升高，但与对照组相比差异不显著性，而从８０ｍｇ／ｋｇ染毒剂量开始，这两个指标显著升高。提示ＺｎＯＮＰｓ染毒浓度是影响肝功能的因素之一。另外，染毒组血中ＡＬＢ含量和Ａ／Ｇ比值显著升高，ＧＬＢ含量有下降趋势，提示可能存在肝脏代偿合成白蛋白增加，而球蛋白消耗增加。我们认为，以上的结果可能与长期暴露导致肝脏的功能代偿及机体处于慢性应激状态有关。本实验中，染毒组小鼠血中ＵＡ和ＢＵＮ含量显著升高，表明存在肾功能障碍，但并未发现明显的病理结构异常，提示本模型中ＺｎＯＮＰｓ所致的肾损伤是功能性的。Ｗａｎｇ［１７］等发现，３００和４００ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ灌胃１４ｄ也可导致小鼠血中ＵＡ升高。
本研究发现，２０ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ经口灌胃６０ｄ可导致肺组织出现间质性炎症，脾脏素沉着较少，红髓颜变淡，脾脏白髓质增多，心肌部分区域出现混浊肿胀的病理变化。这些发现在其他不同浓度ＺｎＯＮＰｓ染毒的啮齿类动物中得到验证。Ｅｓｍａｅｉｌ ｌｏｕ［３］等以３３３．３３ｍｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ给大鼠连续灌胃５ｄ，发现肺组织出现浆液性炎症、肺泡严重充血
、肺水肿等病理变化。Ｗａｎｇ［１８］等以５ｇ／ｋｇＺｎＯＮＰｓ急性经口染毒１４ｄ，发现可导致脾脏肿大。ＨＣ［１９］等以１．１和４．９ｍｇ／ｍ３ＺｎＯＮＰｓ吸入暴露７ｄ，发现可导致ＳＤ大鼠心脏出现炎症和纤维化，暴露３０ｄ后心肌出现变性和坏死。在本实验中，对肠组织进行病理检测并未发现异常，吴城［２０］等研究发现，以９６０ｍｇ／ｋｇ口服染毒ＺｎＯＮＰｓ使得小鼠肠黏膜出现上皮细胞萎缩等症状，可能是本实验ＺｎＯＮＰｓ剂量低尚未引起肠出现损伤。
钟丽丽年龄
综上所述，ＺｎＯＮＰｓ灌胃染毒６０ｄ未引起Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ小鼠出现系统性炎症，但可诱导心脏、肝脏、脾脏和肺脏出现轻度的病理变化，并导致肝功能和肾功能异常。因此，随着ＺｎＯＮＰｓ等纳米材料的广泛应用，了解纳米材料对机体的毒性效应，对其进行安全性评价成为纳米科学领域的重要研究内容。
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在食管癌细胞增殖过程中蛋白酶激活受体 ２（ＰＡＲ ２）对细胞周期蛋白
Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１）的调控机制
张其良１，曹文理２，邓全军３△
（１．天津市第四中心医院消化内科，天津３００１４０；２．天津市北辰医院呼吸内科，天津３００４００；３．武警特医学中心，天津３００１６２）
【摘要】 目的：探讨在食管癌细胞增殖过程中蛋白酶激活受体 ２（ＰＡＲ ２）影响细胞周期蛋白Ｄ１（ＣｙｃｌｉｎＤ１）的机制。方法：方法：使用食管癌ＥＣ１０９细胞株，实验分为：空白对照组、ＰＡＲ ２激动组（加入激动剂ＳＬＩＧＫＶ）、ＰＡＲ ２反激动组（加入反激动剂
ＶＫＧＩＬＳ）、ＰＡＲ ２ｓｈＲＮＡ组（ＰＡＲ ２ｓｈＲＮＡ成功转染）和ＭＡＰＫ抑制组（加入阻滞剂ＰＤ９８０５９）；取对数生长期的细胞，以６×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ的密度接种于培养瓶中，置于孵育箱中培养２４ｈ后使用ＰＢＳ清洗３次，更换为无血清的１６４０培养基培养２４ｈ，之后各
实验组按实验设计分别加入所需试剂，每组设置３个复孔，于孵育箱中继续培养２４ｈ，采用ＲＴ ＰＣＲ法检测ＰＡＲ ２、ＥＲＫ１、ＣｙｃｌｉｎＤ１的ｍＲＮＡ的表达水平；采用Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ法检测ＰＡＲ ２、ＥＲＫ１、ｐ ＥＲＫ１、ＣｙｃｌｉｎＤ１的蛋白表达水平。结果：与空白对照组相比，ＰＡＲ ２激动组ＰＡＲ ２ｍＲＮＡ、ＥＲＫ１ｍＲＮＡ、和ＣｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮ表达明显升高（Ｐ＜０．０５），ＰＡＲ ２、ｐ ＥＲＫ１和ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白表达升高（Ｐ＜０．０５）；ＰＡＲ ２ｓｈＲＮＡ组ＰＡＲ ２ｍＲＮＡ、ＥＲＫ１ｍＲＮＡ和ＣｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达降低（Ｐ＜０．０５），ＰＡＲ ２、ｐ ＥＲＫ１和ＣｙｃｌｉｎＤ１蛋白表达
降低（Ｐ＜０．０５）；ＭＡＰＫ抑制组ＥＲＫ１ｍＲＮＡ和ＣｙｃｌｉｎＤ１ｍＲＮＡ表达明显降
低（Ｐ＜０．０５），ｐ ＥＲＫ１和ＣｙｃｌｉｎＤ１表达降低（Ｐ＜０．０５）。结论：ＰＡＲ ２可通过ＭＡＰＫ通路调节ＣｙｃｌｉｎＤ１的表达从而促进食管癌细胞ＥＣ１０９的增殖。
【关键词】食管癌ＥＣ１０９细胞株；蛋白酶激活受体 ２；细胞外调节蛋白激酶１；细胞周期蛋白Ｄ１；增殖
【ＫＥＹＷＯＲＤＳ】 ｅｓｏｐｈａｇｅａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＥＣ１０９； ＰＡＲ ２； ＥＲＫ１； ＣｙｃｌｉｎＤ１； ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ
【中图分类号】Ｒ５７１ 【文献标识码】Ａ 【文章编号】１０００ ６８３４（２０１９）０６ ５５９ ００４
【ＤＯＩ】１０．１２０４７／ｊ．ｃｊａｐ．５８１５．２０１９．１２３９
５
５中国应用生理学杂志，２０１９，３５（６）
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