第４０卷，第１０期 光谱学与光谱分析Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１ ０，ｐｐ
１ ３－１ ４２ ０ ２ ０年１ ０月 Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ ａｎｄ Ｓｐｅｃｔｒａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｏｃｔｏｂｅｒ，２０２０
宋红红，张卓越，田 婧，冯 娟＊
电子科技大学生命科学与技术学院，四川成都 ６１００５４
摘 要 遗传学编码的光激活近红外荧光蛋白ＰＡｉＲＦＰ１是近年来活体成像领域中的一个非常有潜力的荧光标记蛋白，发射峰在７２０ｎｍ左右，可有效提高成像的信噪比。为了实现多成像，采用ＰＣＲ定点突变，将ＧＡＦ结构域中第２４７位异亮基酸（Ｉｌｅ）突变为半胱氨酸（Ｃｙｓ），该Ｃｙ 江西省煤矿设计院ｓ残基在其他相关荧光蛋白中对于光谱的蓝移发挥了重要作用。通过蛋白质工程、体外ＢＶ组装、以及光谱学检测发现：该Ｃｙｓ残基的引入对于ＰＡｉＲＦＰ１近红外荧光发射最大峰位置并未产生显著影响，但却降低了摩尔消光系数、荧光量子产率等参数。Ｐｙｍｏｌ分析显示：光谱未发生蓝移的原因可能是因为Ｃｙｓ无法与ＢＶ中Ａ环中的特定的双键形成硫醚键所致，相光工作尚待深入研究。
关键词 光敏素；近红外荧光蛋白；定点突变；荧光发射峰文献标识码：Ａ 文章编号：１０００－０５９３（２０２０）１０－００１３－
０２ 收稿日期：２０２０－０３－３０，修订日期：２０２０－０７－
１０ 基金项目：国家科技重大专项（２０１２ＺＸ０７２０３－００３－
Ｚ０４）资助 作者简介：宋红红，女，
１９９５年生，电子科技大学生命科学与技术学院硕士研究生＊通讯联系人 ｅ－ｍａｉｌ：ｆｅｎｇｊ
ｕａｎ＠ｕｅｓｔｃ．ｅｄｕ．ｃｎ ＰＡｉＲＦＰ１是一类以细菌光敏素Ｂｐ
ｈＰ为模板，经过定向进化改造获得的光激活红外荧光蛋白。由于它在蛋白组成上保留了特殊的ＰＨＹ区域，具有光激活行为，因此在肿瘤活体成像研究时，可以通过光激活前后的荧光强度差减，显
著提高成像信噪比［
１－
３］。但
到目前为止，该类遗传学编码的光激活蛋白只能实现单成像，它的发射波长约在７２０ｎｍ左右
［４］
。鉴于多成像不仅能够提高肿瘤检测的准确性，而
且可以同时检测多种肿瘤细胞［５］
，因此在本论文中我们采用
分子生物学技术、结合光谱学手段探讨了将这种蛋白开发成黑暗时代读书写字
多荧光蛋白的可行性。
爱尔纳突击
Ｆｉｇ
．１ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＢＶ ｏｒ ＰＣＢ ａｄｄｕｃｔｓｉｎ ＰＡｉＲＦＰ１ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｐｈｙ
ｔｏｃｈｒｏｍｅ 通过对比植物光敏素、蓝藻光敏素的氨基酸序列、
结构，并结合部分ＢｐｈＰ的前期研究工作［６－７］
，我们发现其ＢｐｈＰ中ＧＡＦ区域的一个特殊Ｃｙ
ｓ可能对于该类素蛋白复合物的光谱学行为具有较大影响（
可靠性计算
见图１）。因此，在本论文中，我们选择将ＧＡＦ结构域中ＳＰＸＨ序列中的不保守氨基酸
（Ｉｌｅ－２４７）突变为半胱氨酸（Ｃｙｓ），构建ＰＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ突变体（
见图２）。随后，通过基因工程手段对目的蛋白进行了表达、纯化和组装。
Ｆｉｇ．２ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＳＰＸＨ ｓｅｑ
ｕｅｎｃｅｓ ｉｎ ＧＡＦ ｄｏｍａｉｎｓｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｐｈｙ
ｔｏｃｈｒｏｍｅｓ 图３给出了野生型和Ｐ
ＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ突变体的近红外荧光发射光谱。由图可知，当用６８０ｎｍ波长激发时，ＰＡｉＲ－ＦＰ１蛋白的最大荧光发射峰位置为７１８ｎｍ，而突变体ＰＡｉＲ－
ＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ其荧光发射峰的位置没有改变。尽管如此，我们
却发现ＰＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ蛋白的荧光量子产率降低至原来的０．１５倍。此外，紫外－可见近红外吸收光谱结果显示ＰＡｉＲ－
ＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ蛋白的Ｐｆｒ态不稳定（见图３），同时计算显示ＰＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ蛋白Ｐｒ态的摩尔消光系数也从３４ ８０４Ｌ·ｍｏｌ－１·ｃｍ－１降低至１４ ２５０Ｌ·ｍｏｌ－１
·ｃｍ－１。我们通过Ｐｙ－ｍｏｌ软件，对这些变化的原因进行了初步分析。如图３所示，
第２４７位氨基酸位于胆绿素（ＢＶ）Ａ环的上方，它突变成Ｃｙ
ｓ残基后，一方面距离和位阻的原因无法与ＢＶ形成共价键；另一方面，突变可能阻碍了发团Ａ环与其他环之间形成的共轭体系的平面性，导致ＰＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃ荧光量子产率和Ｐｒ态摩尔消光系数的显著降低，进一步的原因尚待深入分析
。
Ｆｉｇ．３ Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｏｆ ＰＡｉＲＦＰ１ａｎｄ ＰＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃｉｎ ｔｈｅ ｄａｒｋｎｅｓｓ（ｓｏｌｉｄ ｌｉｎｅ）ａｎｄ ａｆｔｅｒ ２ｍｉｎ－ｆａｒｒｅｄ ｌｉｇ
ｈｔ ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ（ｄａｓｈｅｄ ｌｉｎｅ）ａｎｄ ＮＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｓｐｅｃｔｒａ ｕｐｏｎ ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ ａｔ ６８０ｎ
ｍ ｉｎ ５０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐ
Ｈ ７．８ｃｏｎｔａｉ－ｎｉｎｇ
５００ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＮａＣｌ ａｎｄ ５ｍｍｏｌ·Ｌ－１
ＥＤＴＡ）ａｔ ｒｏｏｍ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＲｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
［１］ Ｐｉａｔｋｅｖｉｃｈ Ｋ Ｄ，Ｓｕｂａｃｈ Ｆ Ｖ，Ｖｅｒｋｈｕｓｈａ
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ｔｏｒｓ ａｓ ａ Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ，ａｎｄＯｐｔｏｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｏｏｌｓ，ｉｎ：Ｋｏｒｎｂｅｒｇ Ｒ Ｄ（Ｅｄ．）．Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．８４２０
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ＰｒｏｔｅｉｎＰＡｉＲＦＰ１ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ
ＳＯＮＧ Ｈｏｎｇ－ｈｏｎｇ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｕｏ－ｙｕｅ，ＴＩＡＮ Ｊｉｎｇ
，ＦＥＮＧ Ｊｕａｎ＊
Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ
ｏｆ Ｃｈｉｎａ，Ｃｈｅｎｇｄｕ ６１００５４，ＣｈｉｎａＡｂｓｔｒａｃｔ Ｔｈｅ ｐｈｏｔｏａｃｔｉｖａｔａｂｌｅ ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ＰＡｉＲＦＰ１ｉｓ ａｎ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ，ａｃｈｉｅｖｉｎｇ
ｈｉｇｈｅｒ ＳＮＲ ＮＩＲ ｆｌｕｏｒｅｓ－ｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｍｉｔｔｉｎｇ ａｔ ７２０ｎｍ．Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ ｉｍａｇｉｎｇ，ｈｅｒｅ ｗｅ ｕｔｉｌｉｚｅｄ ＰＣＲ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｔｏ ｓｕｂｓｔｉ－ｔｕｔｅ ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ（Ｉｌｅ）ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ２４７ｉｎ ｔｈｅ ＧＡＦ ｄｏｍａｉｎ ｔｏ ｃｙｓｔｅｉｎｅ（Ｃｙｓ）．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ ｄａｔａ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｕｎｌｉｋｅ ｏｔｈｅｒ Ｂｐ
ｈＰ，ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｂｉｇ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｂｌｕｅ ｓｈｉｆｔ ｆｏｒ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｐｅａｋ．Ｎｅｖｅｒｔｈｅｌｅｓｓ，ｔｈｅ ｍｏｌａｒ ｅｘｔｉｎｃｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｕｍ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｔｈｅ ＰＡｉＲＦＰ１／Ｉ２４７Ｃｍｕｔａｎｔ ｗｅｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｒｅｄｕｃｅｄ．Ｐｙｍｏｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｗａｓ ｄｏｎｅ ｆｏｒ ｇａｉｎｉｎｇｓｏｍｅ ｅｘｐ
网贷风控系统ｌａｎａｔｉｏｎ．Ｋｅｙ
ｗｏｒｄｓ Ｐｈｏｔｏｃｈｒｏｍｅ；Ｎｅａｒ－ｉｎｆｒａｒｅｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ；Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｐｅａｋ（Ｒｅｃｅｉｖｅｄ Ｍａｒ．３０，２０２０；ａｃｃｅｐ
ｔｅｄ Ｊｕｌ．１０，２０２０） ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
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１光谱学与光谱分析 第４０卷
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