环状RNA研究之PAR-CLIP
CLIP (UV-crosslinking and immunoprecipitation)是研究蛋⽩质和RNA 相互作⽤的重要技术，它利⽤了蛋⽩质和RNA 在256 nm 紫外光照射下会发⽣共价交联的特性。但是CLIP 是较难掌握的⼀种技术。由于紫外交联的效率很低(1%~5%)，交联的RNA 含量很少，RNA容易降解，RNA 连接效率低，实验流程复杂(~100步) 等因素都增加了应⽤CLIP 的难度。
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为了提⾼紫外交联效率，科学家开发了PAR-CLIP ( photoactivatable – ribonucleoside - enhanced CLIP) 技术，可以将交联效率提⾼100~1 000 倍。这个⽅法中最重要的⼀点就是依赖了具有光活性的核糖核苷类似物，例如4-硫尿核苷，在活体细胞中将其插⼊到新⽣RNA转录本中。在365nm紫外灯辐射的细胞中，光活性的核糖核标记的RNA被诱导与RBP 相互作⽤。免疫共沉淀所要的RBP，然后分离被交联和共沉淀的RNA。RNA随即被转换成cDNA⽂库并且进⾏深⼊测序。当使⽤4-硫尿核苷时，交联的序列将会产⽣T-C的转变，因此通过PAR-CLIP所准备的cDNA⽂库能够准确的定位交联的位置。 PAR-CLIP 流程图
（Methods Mol Biol. 2016;1361:77-90）
具体实验⽅法
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试剂准备
▲ 1. 4-硫尿核苷储存液 (1 M): 260.27 mg 4-硫尿核苷, 1 ml DMSO
▲ 2. 多西环素储存液(10 mg/ml): 10 mg 多西环素, 1 ml DMSO
▲ 3. 5× NP40 裂解液: 制备⽆DTT和蛋⽩酶抑制剂的5×的储存液, 50 mM HEPES (pH 7.5), 150 mM KCl, 2 mM EDTA, 1 mM NaF, 0.5% (v/v) NP40
▲ 4. 柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液: 4.7 g/L 柠檬酸, 9.2 g/L Na2HPO4, pH 5.0 ▲ 5. IP洗涤缓冲液: 50 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 300 mM KCl, 0.05% (v/v) NP40
▲ 6. ⾼盐洗涤缓冲液: 50 mM HEPES-KOH (pH 7.5), 500 mM KCl, 0.05% (v/v) NP40
▲ 7. 脱磷酸缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH 7.9), 100 mM NaCl, 10 mM MgCl2 and 1 mM DTT
▲ 8. 磷酸酶洗涤缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 20 mM/review/reagent/EGTA.html EGTA, 0.5% (v/v) NP40
▲ 9. 多核苷酸激酶 (PNK)缓冲液⽆DTT: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2
▲ 10. PNK 缓冲液: 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT
▲ 11. SDS-PAGE loading buffer: 10% glycerol (v/v), 50 mM Tris-HCl (pH 6.8), 2 mM EDTA, 2% SDS (w/v), 100 mM DTT, 0.1% bromophenol blue
▲ 12. 2×蛋⽩酶K缓冲液: 100 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 12.5 mM EDTA, 2% (w/v) SDS
▲ 13. 5× NP40 裂解液、IP洗涤缓冲液、⾼盐洗涤缓冲液等在实验前直接加⼊0.5 mM DTT和⽆EDTA的蛋⽩酶抑制剂cocktail (Roche) 后使⽤。
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实验步骤
01
细胞培养和体外交联
1) 在培养⽫中培养增殖细胞（15cm 培养板，需20-50块板），培养⾄饱和度为80%。
2) 直接加⼊4-硫尿核苷⾄终浓度100µM⾄细胞培养液中。
3) 在交联后14⼩时，每块板中⽤10ml预冷的1×PBS洗⼀次细胞，然后完全移除PBS。
4) 将培养板放在有冰的托盘上，并且在0.15 J/cm2、365nm的紫外灯下进⾏照射。
5) 在培养板中加1ml1×PBS，然后⽤橡胶棒将细胞刮下，将细胞转移到50ml离⼼管中，4℃下500g离⼼5min，去除上清液。
02
RNA酶T1消化
1) 在沉淀的细胞中加⼊3倍体积的1×NP-40裂解缓冲液，并且在冰上静置10min。
2) 将细胞裂解液在13,000g、4℃下离⼼15min，弃沉淀。
3) ⽤0.2um膜注射器式滤器进⼀步清洗细胞裂解液。
4) 加RNA酶T1⾄终浓度1U/µl并且在22℃⽔浴锅中孵15min。然后在冰上使其反应5min。
03
1) 每毫升细胞裂解液加⼊10µ蛋⽩ G 磁珠颗粒到1.5ml⼩试管中。⽤1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液清洗珠⼦两遍。
2) 按照原来珠⼦混悬液的体积再⽤两次同体积的柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液重悬。
3) 每毫升悬液加0.25 µg特异性抗体，然后在室温进⾏40min旋转孵育。
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4) ⽤1ml柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液洗珠⼦两次。
04
免疫共沉淀
1) 加⼊20µl新配置的抗体-磁珠处理细胞裂解液(⽤RNA酶T1处理)，然后在4°C下15ml离⼼管中旋转混匀1h。
2) ⽤磁⼒分选器收集磁珠，并转⼊到1.5ml⼩离⼼管中。
3) ⽤IP缓冲液清洗珠⼦3次
05
第⼆次RNA酶T1消化以及去磷酸化
1) 加⼊RNA酶T1⾄终浓度100 U/µl，然后在22°C⽔浴锅中孵育珠⼦混悬液15min，接着在冰上静置5min。
2) ⽤⾼盐缓冲溶液洗珠⼦三次。
3) ⽤等体积的去磷酸缓冲液重悬珠⼦。
4) 加⼊⼩⽜⼩肠碱性磷酸酯酶⾄终浓度0.5 U/µl，然后在37°C下静置混悬液10min。
5) ⽤1ml磷酸盐缓冲液洗珠⼦两次
6) 在不含有DTT的多核苷酸激酶中洗珠⼦两次。
7) ⽤原来体积的珠⼦PNK缓冲液重悬珠⼦。
06
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标记RNA⽚段并交联
1) 加γ-32P-ATP⾄终浓度0.1 µCi/µl和T4多核苷酸激酶⾄终浓度1 U/µl到上⾯的珠⼦混悬液。37°C下静置混悬液
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2) 加⼊⽆放射性标记的ATP到终浓度100µM，然后再在37°C下静置混悬液5min。
单晶纳米铜3) ⽤800µl不含有DTT的多核苷酸激酶的缓冲液洗珠⼦5次。
4) 在65µl⼗⼆烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）加样缓冲液中重悬珠⼦。
07
磁单极子电泳、洗脱和消化
1) 将放射线标记的混悬液在95℃加热器上加热5min（使其变性并释放同交联的RNA的免疫共沉淀的RBP），然后涡旋。
2) 在磁⼒分选器上将磁珠移除，并将上清液转移到新的1.5ml的⼩试管中。
3) 每个孔道中加40µl Novex Bis-Tris 4-12%预处理过的上清液，然后跑聚丙烯酰胺凝胶（200V、45-60min）。
4) 将胶从胶槽中拿出，将胶放在⼀个平板上。为了使胶上的⽚段在磷光指⽰带上被标出，我们植⼊三个⼩的放射性的胶段到胶三个⾓中。放射性胶段能从胶中收集，被最先⽤来纯化放射性标记的合成寡聚核苷酸。
5) 将胶包起来放置在空⽩的磷光板上扫描1h使其完全显现。
6) 将胶摆在磷光板上⾯，使⽤植⼊的胶段来⽤作定位。将预计的RBP⼤⼩⽚段的胶带切下，然后转移到透析柱中，加⼊800µl 1×SDS电泳缓冲液。
7) 在1×SDS电泳缓冲液中、100V下电洗脱交联的RNA-RBP混合物2h使其从胶中分离出来，切断胶条然后在D型管中电洗脱。
8) 加等体积的2×的蛋⽩酶K缓冲液到电洗脱物中，然后在加蛋⽩酶K⾄终浓度1.2mg/ml。55℃静置30min。
9) ⽤酸性的苯酚/氯仿/碘⼄酰胺（25:24:1，pH=4.0）来还原RNA，紧接着⽤氯仿萃取。加1µl糖原（10mg/ml）和3倍体
9) ⽤酸性的苯酚/氯仿/碘⼄酰胺（25:24:1，pH=4.0）来还原RNA，紧接着⽤氯仿萃取。加1µl糖原（10mg/ml）和3倍体积的⼄醇来沉淀RNA。⽤10µl⽔来溶解沉淀。
08
cDNA库和⾼通量测序
富集下来的RNA加3’接头，5’接头，然后逆转录后，PCR扩增获得从DNA⽂库，使⽤⾼通量测序技术进⾏测序并进⾏⽣物信息学分析。
参考⽂献：
1. PAR-CLIP (Photoactivatable Ribonucleoside-Enhanced Crosslinking and Immunoprecipitation): a step-by-step
protocol to the transc riptome - wide identification of binding sites of RNA-binding proteins.Methods Enzymol.
2014;539:113-61 .
2.Mapping the Transc riptome-Wide Landscape of RBP Binding Sites Using gPAR-CLIP-seq: Experimental
Procedures.Methods Mol Biol. 2016;1361:77-90.
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