第一天
1、配置LB培养基:
酵母粉15g、胰蛋白胨30g、氯化钠30g,定容至3000ml。调节PH至7.4(2M NaOH),高压蒸汽灭菌20分钟,37℃保存。分装成15瓶(每瓶200ml)。
取4瓶上述培养基,每瓶加200µlAMP(1:1000)、60µl菌液。37℃过夜。 笛卡尔坐标第二天
1、扩大培养(超净台)
4瓶扩至16瓶,每瓶培养基加200µlAMP,摇床培养1小时左右。
2、温泉浴片诱导(超净台)
加40µlIPTG,加完后去除封口的除牛皮纸,扎口较松。25℃摇床培养4小时。
3、离心获取菌体
凯恩斯大战哈耶克4℃,8000rpm离心25分钟。注意配平。
4、超声波破碎菌体
离心后去上清,向沉淀加入(600mlPB裂解液、300µl溶菌酶、3mlPMSF)。将菌液转入2个烧杯中,冰浴超声波破菌,400W,75次,每次6秒,间隔2秒。离心收集上清液。 慰项石600mlPB裂解液:20mM/L PB,10mM/L EDTA,5%甘油,1mM/L DTT,调节PH至7.4。
超声波破碎:首先用去离子水清洗探头,再将盛有菌液的小烧杯置于有冰水混合物的大烧杯中,冰水界面略高于菌液面即可。探头浸没于菌液中,不可伸入过长。注意破菌过程中由于冰的融化导致的液面变化。 5、抽滤(双层滤纸)
洗胶(GST)。将上述上清液抽滤,滤液与GST胶混合,磁力搅拌过夜。
第三天
神龙赋1、抽滤蛋白-胶混合液,滤液取样20µl,留电泳。ds精神
2、洗杂蛋白,用1×PBS+PMSF(1000:1)约400ml,洗脱若干次,用移液吸去上层泡沫(杂蛋白),至胶上无泡沫为止。 3、洗脱目的蛋白,洗脱液加50ml,分3次进行(15+15+15),每次加入后间歇搅拌,自然静置洗脱15分钟,抽滤,勿使胶干,合并洗脱液,取样20µl,留电泳。用洗脱液调零,测OD280。(OD值达到1.5为佳)
4、将洗脱液置于透析袋中(透析袋应提前煮好),将透析袋置于2L透析液1中,加入磁珠置于4℃冰箱内磁力搅拌器上,4小时后换为透析液2。胶的回收:用3M氯化钠溶液(用1×PBS溶液溶解)、1×PBS(无沉淀)洗涤,20%乙醇洗脱,装瓶。
洗脱液:50mM/LTRIS-HCL 、10mM/LGSH
透析液1:20mM/L TRIS-HCL、 1mM/L EDTA 、 0.15mM/L DTT
透析液2::0.5mM/L EDTA、1×PBS