抗体偶联药物 (ADC)，强效小分子细胞毒素通过化学键与单克隆抗体结合，比抗体具有更复杂的结构。本文详细描述了应用物理化学方法对抗体偶联药物进行表征研究。对于特定 ADC 最合适的方法，取决于接头、药物和药物的性质，偶联位点的选择（赖氨酸、链间半胱氨酸、Fc聚糖）以及分析技术的改进。例如蛋白质质谱和毛细管电泳技术可以显著提高研究水平，可用于产品表征、常规批次放行和稳定性研究。 简介
抗体偶联药物 (ADC)成为癌症临床研究中一类重要的药物。例如本妥昔单抗（SGN-35）用于CD30 阳性恶性肿瘤（霍奇金淋巴瘤）；曲妥珠单抗（T-DM1）应用于人表皮生长因子受体 2 (HER2) 阳性转移性乳腺癌。ADC 作为一类利用单克隆抗体 (mAb) 的靶向选择性来实现细胞毒性的靶向递送。由于这种靶向性，ADC 选择性地消除过度表达靶抗原的肿瘤细胞，同时限制药物对正常健康组织的毒性。ADC 的临床疗效取决于靶点特异性、接头和药物种类、体外和体内稳定性、药物的效力、以及药物种类的分布及小分子偶联数量。因此了解 ADC 的物理化学性质和选择适当的分析技术，以便在制造和存储过程中对其进行评估
和质量监控尤为重要。ADC 由三个组件构成：特异于肿瘤抗原的抗体、高效细胞毒素和使细胞毒素能够与单抗共价连接的接头（连接子）。
主要用于蛋白质定向偶联的位点是赖氨酸残基或链间半胱氨酸残基的巯基及抗体偶联位点改造。共轭通常从功能化单克隆抗体通过双功能接头的任一连接，以减少链间二硫键共轭，然后与细胞毒物（如作为含硫醇的 DM1)，或与预先形成的药物接头（例如vc-MMAE）反应。不同的偶联位点及偶联过程都会导致 ADC 分子在载荷及分布上的异质性，这种异质性从过程控制和分析开发的角度来看都是具有挑战性的。通过优化工艺开发策略及蛋白质工程应用方面的努力，可以减少这种异质性的发生。为此，可以利用丝氨酸选择性地替换链间半胱氨酸。另外，对半胱氨酸偶联位点进行优化，明确药物偶联比，可以降低偶联对单抗的结构及性能造成的影响。
抗体偶联药物如图1所示：
图1：抗体偶联药物化学结构。用于每种药物的接头在括号中标出，阴影部分为可降解基团。图例所示，腙在酸性条件下在靶细胞的溶酶体内释放药物，二硫化物在细胞内还原，肽被溶酶体蛋白酶酶解。
这些药物包括对DNA进行烷基化从而抑制癌细胞的生长，例如加利车霉素；微管蛋白抑制剂，例如美登素。对于任何给定的 ADC，细胞毒素和接头的化学性质，以及连接位点的选择（ADC“架构”），将极大地影响物理化学属性，评估这些属性的分析方法的选择取决于ADC框架结构。不同的ADC可能有不同的分析方法，相同的测定方法（例如，基于电荷的分析或在变性条件下评估 ADC 的结构）可能会提供不同的信息。本文总结了ADC分析表征的方法。在某些情况下，这些方法也可以用于常规放行以及稳定性研究。同时对ADC结构表征也进行了阐述。苏-39攻击机
抗体药物偶联比（DAR）
ADC 最重要的质量属性之一是偶联药物的平均数量（DAR），因为这决定了可以输送到肿瘤的“有效载荷”，可以直接影响安全性和有效性。多种方法可用于测量此属性，具体取决于药物的特性及其与蛋白质的（即结合位点和连接子的结构）。
最简单的DAR分析技术是UV/VIS。此方法要求药物和抗体的光谱具有不同的最大吸收波长。ADC 在抗体或者药物最大吸收波长下的吸光度等于抗体消光系数与浓度的乘积加上药物消光系数与浓度的乘积。其中不同波长下的消光系数需根据单组分浓度提前测定。联立
两个ADC吸光度方程，根据方程可计算裸抗和药物的浓度，并根据药物与抗体的摩尔浓度比计算DAR。药物在280nm下的吸收值以及抗体在药物最大吸收波长下的吸收值都要算入ADC的吸收值中。正交方法的应用也验证了光谱技术的有效性，包括使用辐射测量方法（共轭用放射性标记药物 ) 和谱方法，如疏水相互作用谱 (HIC) 分离。
还原链间二硫键以产生游离巯基，在特定残基处使用含有马来酰亚胺的接头偶联并产生具有每种抗体结合 0、2、4、6 和 8 种药物。由于这种连接化学的异质性显着降低（相对于赖氨酸连接），该混合物可以使用疏水相互作用谱 (HIC) 进行分析。如图2所示。HIC可以检测不同偶联个数的分布，并通过每个对应峰面积比计算平均DAR值 。HIC 在非变性下进行，在中性 pH 条件下，从高盐到低盐的梯度洗脱，通常在低盐流动相中添加低浓度的有机相可以改善洗脱峰型。即使链接二硫键部分被破坏，链之间共价结合和强非共价力的结合足以在分析过程中保持单位状态完整。因此，图2中每个峰对应完整抗体偶联药物的个数。
图 2. TOSOH Biosciences Butyl-NPR 谱柱上对 mAb-vc-MMAE 进行疏水相互作用谱 (HIC) 分析产生五个主要峰，对应于含有0、2、4、6和8个药物的抗体。另外归一化 280 nm 处吸光度，显示 248 nm 处吸光度随着偶联药物水平的增加而增加。
药物分布
除了关于平均 DAR 的信息外，还有多个方法已被用于分析药物相关形式的分布（例如，含有0、1、2，…，n 个药物的占比）。这是一个重要的 ADC 特性。因为不同的形式可能有不同的药代动力学和毒理学特性。由于它们的高度异质性，通过谱分析并不是那么容易。许多研究使用质谱来研究他们的药物分布。质谱分析：1990 年代初期，ADC 质谱表征首次描述了 UV MALDI-TOF 仪器的使用。虽然 MALDI-TOF 方法对于大分子的相对质量精度较差，其有限的分辨率无法提供不同药物的负载，观察到的峰值质量偏移计算平均载药量，峰形用于对其分布进行数学建模。对于赖氨酸偶联药物，观察到未偶联抗体及其相应的 ADC 轻链和重链质谱迁移，表明两条链都被修饰。使用活化的紫杉醇制备的赖氨酸连接的偶联物使用 UV MALDI-TOF MS 进行分析，这种方法也用于确定平均 DAR。使用飞行时间耦合电喷雾电离的 LC-MS(TOF) 或三重四极杆质量检测器，可以提供更高的质量精度和分辨率。将 SEC 谱与 ESI-MS 相结合，从样品中去除缓冲液成分并提高光谱性能。图3为使用该方法获得的去糖基化 huC242-DM4 的去卷积质谱示例。因为赖氨酸连接的偶联物含有完整的二硫键，在高酸性和高有机溶剂相存在下抗体链不会解离，用链间半胱氨酸连接的偶联物会观察到电离效应。可以获得完整 ADC 的每种药物形式的准确质量。
解卷积质谱的积分可以用于估计 DAR；然而，这假设基于所有物质的等效回收和电离，然而，由于电荷变化及与带正电荷的胺的结合导致的疏水作用。情况往往会更加复杂。与带正电荷的胺的结合有关物质的电荷和疏水性都会影响 MS 的准确性。因此，必须通过实验验证等效电离和回收率的假设。与紫外光谱和 ESI-TOF-MS 比较表明， MS 方法经过优化会得到较好的数据。
图3：去糖基化 huC242-DM4 的 SEC/ESI-MS 去卷积质谱。每个峰上的标签是指结合药物的数量。右上图为蛋白质的 SEC 洗脱。激光对抗
对于赖氨酸偶联，非还原条件下，MS显示完整偶联物的解卷积谱图，显示了预期质量的分布。还原条件下，两条链被HPLC分离，重链和轻链的偶联个数可以从MS获取。轻链偶联个数0，1。重链偶联个数0，1，2，3。不同于赖氨酸偶联，半胱氨酸药物通过LC-MS不能直接体现药物偶联分布情况，因为药物会在电离的酸性环境下游离出来。尽管如此，LC-MS依旧可用于还原的共轭物确认峰分配。
谱分析药物分布
对于抗体偶联药物，可以使用疏水作用谱（HIC）来测定半胱氨酸连接或者特定位点偶联物中药物抗体偶联比。通过HIC分离单峰可以进行其他研究，例如SEC-HPLC、ELISE、细胞活性等。图2显示通过HIC分离单克隆抗体-vc-MMAE偶联物，每一个峰对应不同的偶联个数。对于赖氨酸偶联，如果药物本身不带电荷，偶联会减少抗体的净电荷。基于电荷的分离，例如离子交换谱法 (IEC)、等电聚焦凝胶电泳 (IEF) 或毛细管等电聚焦 (cIEF)可以估计这些 ADC 的药物分布。IEC和IEF表明这些偶联物实际为混合物，含有50%的裸抗未偶联。改变偶联条件可以降低裸抗的含量，如果偶联的药物带有电荷则会影响偶联物的PI。
反相高效液相谱法由于低pH和高有机溶剂的变性作用，可用于分离和定量不同药物载量的轻、重链。RP-HPLC分离对于特定位点(链间半胱氨酸)偶联的形式有效；然而使用RP-HPLC分析赖氨酸连接偶联物还没有成功的报道。
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图4(A-D)反相高效液相谱分析使用不同还原/再氧化方案生成的DTT还原偶联物。(E-H)对应于(a - d在非还原性条件下CE-SDS分析的样品。
对于半胱氨酸连接的偶联物，可以通过谱(RP-HPLC)测定每个偶联重链和轻链药物的加
权峰面积百分比来计算平均DAR。用该方法得到的DAR与基于药物和抗体紫外吸收的分光光度法有良好的相关性。RP-HPLC还用于表征与工程单克隆抗体相关的位置异构体，其中形成链间二硫键的半胱氨酸被丝氨酸残基取代通过反相高效液相谱(RP-HPLC)测定了与两种、四种和六种药物/mAb的同分异构体分布。
分子排阻谱分析偶联药物
人造神与任何蛋白一样，ADC中存在的高分子(即聚集物)有可能引发抗性抗体(ATA)反应。ATA反应的潜在临床结果可能是以下任何组合：输液相关反应，产品药代动力学的改变(即更快的清除)和减少药物暴露。许多与抗体结合产生ADC的药物是相对疏水的，会增加生产过程或者储存过程中聚集形成的可能性。因此，在放行检测测试和稳定性检测中，都需要精确和有效的方法来测量聚合和碎片的程度。通常使用与本身单克隆抗体相同的尺寸排除层析分析。例如，Willner等人报道的含有DOX的偶联物在TSK 3000SW上进行了分析，用磷酸缓冲盐水洗脱。然而该方法应用于ADC时，显示出较差的峰形和单体与聚合(例如二聚体)的不完全分离。在Doronina等人的研究中，结合BR96起始单抗的SEC比较显示ADC的保留时间和峰尾略有增加。这表明，附着的疏水药物导致ADC与柱固定相之间的非
特异性相互作用。在流动相中加入有机改性剂，如25%丙二醇，10% DMSO或15%乙腈，可以克服谱性能中的非特异性影响，并且对恢复峰形和分辨率也有很好的效果(图5所示)。除了消除与共轭物洗脱有关的峰拖尾和单体与二聚体分离度差的问题，溶剂的加入使得T-DM1单体和未偶联的单克隆抗体的保留时间相同(图5B所示)。
图5：TSK 3000SWXL谱柱以0.5 mL/min流速进行SEC分析，吸光度为280nm。(MPA)移动0.2 M KPi和0.25 M KCl, pH 6.95。(B) 85% KPi/KCl流动阶段;15%异丙醇。
SEC是在非变性条件下进行的，并且如上所述的HIC分析，不会导致链间二硫化物修饰形成的非共价抗体链的解离。SEC分析可以用于通过抗体铰链处的裂解来量化片段的形成，这是一种典型的非酶解反应，经常在液体制剂存储的单抗中观察到。在变性条件下对还原性和非还原性ADC偶联物进行结构表征，而这在完整蛋白水平上无法轻易评估。对于在非变性条件下(例如SEC和HIC分析)抗体和链的高亲和力导致ADC作为一个完整的分子洗脱。传统上，SDS-PAGE用于蛋白质的分子量分离。一些报道已经描述了通过SDS-PAGE还原ADC来解析非偶联形式的药物链。CE-SDS已经成为首选技术，在速度、重现性、分辨率和易于自动化方面明显优于SDS-PAGE。如图4E-H所示，CE-SDS技术对cAC10-vc-MMAE结合物的分析。枣阳市委书记
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