免疫荧光和免疫组化
问题如下：
1. 免疫荧光好还是做免疫组化好？我倾向于做免疫组化，但老板倾向做荧光，我想两种方法都了解一下，能否介绍一下两种方法的详细步骤（protocol）。局域表面等离子体共振
2. 一抗、二抗抗体（包括荧光抗体）如何选择，哪个公司的比较好？浓度怎么掌握？
其实IHC和IFC本质都是一样的。只是最后的显方法不一样，IHC是用酶加底物进行显反应，用普通光镜观察；IFC是直接用带有荧光物质连接的二抗与一抗结合，在相应波长的激发光下观察。
我也倾向于IHC，理由如下：
IHC的级联放大作用使得抗原比较少的组织也能有很强的着。我一般用Vector公司的Elite系列ABC kit，HRP－DAB显系统。
IHC的切片可以长期保存。很多时候试验做出来了，需要反复的子。而IFC的有荧光猝
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灭，无法长久保存。所以不利于反复阅片。
IFC有利于做Multiple Labeling，比如在同一location的两种或多种抗原的比较，通常用IFC；IFC还多用于活细胞的staining，但如果是石蜡切片，总会有一些自发荧光现象存在。所以个人认为，能用IHC的时候建议不用IFC。 详细protocol请在本版内search一下，已经有很多的讨论了。
一抗通常买DAKO、SIGMA、VECTOR，二抗可以选择相应公司的，也可以买SANTA CRUZ的，比较便宜一些。荧光二抗建议买Molecular Probe的，现在和Invitrogen合并了。
浓度先参考data sheet上的，不过还是自己要optimize一下，比如建立个浓度梯度。阴性对照用相同种属来源动物的IgG。
供参考。
GOOD LUCK!
免疫荧光结果分析及抗体选择——许多问题你思考过吗？
辽宁中医药大学学报www.dxy/bbs/topic/24548838?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%E7%BB%93%E6%9E%9C%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7%96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97冲走小老鼠
免疫荧光因其直观、彩鲜明而被广泛用于检测各种蛋白的定位表达。 （1）免疫单标
此时与免疫组化的用途相近，仅能检测待测蛋白在细胞中的表达部位，如细胞核，细胞浆及细胞膜。
疑问：许多蛋白既在细胞核又在细胞浆表达，某蛋白活性发生变化后主要表现在该蛋白在细胞核与细胞浆存在表达量的差异（如NF-KB/ERK等）。因此某些实验的研究目的就是观察某种干预后这些蛋白是否存在活性的变化。针对这种细胞核和细胞浆均存在蛋白表达的蛋白质分子，单一的免疫荧光是否能说明问题，是否需要DAPI染协助说明该蛋白的细胞定位？此时会出现多种可能，（1）两种染不重合（不同细胞分别染）；（2）两种染重合但不叠加（同一细胞分别在细胞核DAPI染和细胞浆待测蛋白染）；（3）两种染叠加（同一细胞同时在细胞核两种染）；（4）两种染重合且叠加（同一细胞细胞核DAPI染及待测蛋白细胞核及细胞浆染）。此时DAPI染是否有这个必要。
（2）免疫双标
很多情况下，某一蛋白在同一样本同一组织不同的细胞系表达，如脑组织中的神经元和神经胶质。为了观察某一蛋白的表达变化，设计严谨的实验需要进行免疫荧光双标染，除了明确蛋白的结构定位（细胞核、细胞浆及细胞膜）还要进行细胞定位。
疑问：如何选择细胞标记物，如神经元有NeuN(细胞核)、NSE（细胞浆）、MAP-2(胞浆及轴突)，但推测待测蛋白在神经元的细胞核表达，需要选择神经元的标记物为NeuN(细胞核)还是其他，结果如何分析。
以上疑问困惑很久，以前只知道盲目实验，论文写作过程中才发现出现很多问题，而且也经常被审稿老师追问，希望各位老师及战友分享自己的经验，大家共同提高！
（1）
我以为，IF能提供一种形态学上的translocation的趋势的证明，如很多beta-catenin的研究都会用到IF以证明其转入胞核中，而其中，我所见的绝大部分都没有用到DAPI。因为单染的效果很明显，空的圆圈肯定是胞核嘛。不染DAPI的效果已经足够好。即使染了，也不宜
converge，因为DAPI会掩盖胞核的beta-catenin荧光信号，也只能平行放一张证明那个空圈是胞核，其实这样就意义不大了。我想这是很多人没有染/展示DAPI的原因。
当然，如果要进一步说明问题，还是分别提胞浆和胞核的蛋白，分别作WB以定量的好。TF的可以直接做EMSA。
（2）
“为了观察某一蛋白的表达变化，设计严谨的实验需要进行免疫荧光双标染”用IF来说明蛋白的表达变化，实在是不靠谱，荧光强度的影响因素太多了。IF只是提供定位而已。
双标marker选择的话，核marker和胞浆marker其实都可以的。具体是看converge后，能否很好地标示出两种抗体都是染在同一个细胞上。如果用NeuN，没有胞浆形态，似乎不太好看，但是有没有double到就看得很明显。MAP-2的话，有时候染效果不好，难以分辨出单个细胞，需要费点劲挑出典型的double的细胞。但如果染得好，效果就很漂亮了。当然，提供共聚焦的三维图片是更好了。但是，如果二维图片很典型的话，一般是认可的。
某些完全在胞浆表达的蛋白如果染成功，的确能清晰看到空的圆圈（为未染的完整的
细胞核），如果加染DAPI仅仅是使胞浆和胞核重合，converge后看到一个完整的细胞，对分析意义不大。某些蛋白既可在胞浆又可在胞核，单染后同样可能在胞体中间发现不规则的空圈，此时主观的判断表达部位，容易被审稿老师提问，要求DAPI进行参考定位（这就是发帖判断这种要求是否科学的缘由）。
（2）双标marker选择的话，核marker和胞浆marker其实都可以的。具体是看converge后，能否很好地标示出两种抗体都是染在同一个细胞上。如果用NeuN，没有胞浆形态，似乎不太好看，但是有没有double到就看得很明显。MAP-2的话，有时候染效果不好，难以分辨出单个细胞，需要费点劲挑出典型的double的细胞。但如果染得好，效果就很漂亮了。当然，提供共聚焦的三维图片是更好了。但是，如果二维图片很典型的话，一般是认可的。
至于选何种marker，一直不知道选择的标准，如果是根据converge后，能否观察两种抗体都在一个细胞上，我认为各种marker都是可以选择的。通风管路
（3）用IF来说明蛋白的表达变化，实在是不靠谱，荧光强度的影响因素太多了。IF只是提供定位而已。
完全赞同以上观点，我的理解免疫荧光实际只能回答有或无及在哪里。经常看到这样的文献探讨某一干预措施对X蛋白表达的影响。将研究对象分为正常组、模型组、不同剂量干预组，然后均采用免疫双标观察此蛋白在各组中的表达，这样的设计是否合理？（此处不讨论WB定量），有无必要？如何设计免疫荧光的检测？
免疫荧光抗体能用于免疫组化吗？因某公司只有用于免疫荧光的抗体，但我要做免疫组化。可以用吗？
www.dxy/bbs/topic/12680657?keywords=%E5%85%8D%E7%96%AB%E8%8D%A7%E5%85%89%20%20%E8%83%BD%E4%BB%A3%E6%9B%BF%E5%85%8D%E7%96%AB%E7%BB%84%E5%8C%96%E5%90%97
免疫荧光和免疫组化使用的切片一般都不同，一个是冰冻切片，一个是石蜡切片，所以切片上面的目的蛋白的修饰程度都不一样，所以很多情况下是不能通用的。你想如果都能通用，哪个公司的抗体说明书上还区别IF和IHC啊，全都写上不是更好！所以选择抗体一定要在用途那一栏到自己需要的具体用途。
santa的那种抗体，还是做个IF试试吧，不行最起码还可以投诉，没准还可以更换一支，做IHC做不出来根本没有投诉的可能。祝好运！
原理其实是一样的，最好做冰冻切片
石蜡切片照样可以做免疫荧光的，只不过需要抗原修复，尽量不要用H2O2阻断（据军科院的老教授说会减弱荧光显）怎么下载
可以用于免疫荧光的抗体当然可以用于免疫组化，前面的原理都是一样的，只不过二抗一个选的是辣根酶标记的，一个是荧光素标记的，当然免疫组化跟免疫荧光所需的条件不同，需要重新摸索适当的浓度比例
如果免疫荧光做出来了，说明一抗可以和目的蛋白结合，二抗跟一抗结合也没问题，那么免疫组化做不出就可以怀疑是二抗问题了
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