阿霉素致大鼠慢性心力衰竭模型建立

-基础研究•

阿霉素致大鼠慢性心力衰竭模型建立

张译心42纪凤兰2王鑫2王晓42刘博2温富春2丁涛2徐惠波2

(1长春中医药大学，吉林长春18613；2吉林省中医药科学院)

〔摘要〕目的探讨建立稳定阿霉素(ADR)致大鼠慢性心力衰竭(CHF)模型的方法及规范模型评价指标。方法Wotar大鼠分3批，每批分为空白组(A、D、G)，模型组(B、E、H)，阳组(C、F、))。试验开始后B、C组腹腔注射ADR 05mg/kg,2次/w，连续9w,A组同时腹腔注射同体积生理盐水3ml/kg；C组灌胃芪苈强心胶囊4.83g/kg,I次/0，连续730,A组、B组同时灌胃同体积蒸馏水3ml/kg；E、F组腹腔注射ADR6.4mg/2g,I次/w，连续4w,D组同时腹腔注射同体积生理盐水3ml/kg；F组灌胃芪苈强心胶囊4.33g/kg,I次/0，连续0-U,D、E组同时灌胃同体积蒸馏水14ml/kg；H组、、组腹腔注射ADR3.4mg/kg h次/w，连续8w,G组同时腹腔注射同体积生理盐水-4ml/kg;)组灌胃芪苈强心胶囊4.33g/kg, -次/0，连续56U,G、H组同时灌胃同体积蒸馏水3ml/kg o试验结束后观察大鼠存活率、心功能、心脏指数、心肌组织病理形态改变及心肌细胞凋亡情况，酶联免疫吸附试验(ELISA)检测心肌组织B型利钠肽(BNP)含量,Western印迹检测心肌组织C aS h aS eC,Bcl-9,Bcq蛋白表达。结果3.4mg/kg ADR组大鼠存活率高于05、2.4mg/kg ADR组。与空白组比较，模型组左心室收缩压(LVSDP)、左心室内压最大上升/下降速率(

±dy/kt mcp)、心脏指数均显著降低(P<4.4-；P<4.45),BNP含量显著升高(P<4.41)；心肌出现病理损伤，左心室心肌壁厚度显著降低(P<4.41)，心肌凋亡指数显著升高(P<2/-)，心肌组织蛋白Casyase3、Bax表达增加(P<4.45),BT-2表达降低(P<4.45)，心肌细胞凋亡明显(P<4.45)。芪苈强心胶囊后，各项检测指标与模型组比较均有显著改善(均P<4.45)。结论采用腹腔注射ADR3.4mg/kg,I次/w，连续8w的方法可制备稳定的CHF动物模型。

〔关键词〕阿霉素；慢性心力衰竭；心功能；心脏指数

〔中图分类号〕R995.0；R272.0〔文献标识码〕A〔文章编号〕10552252(2021)12257626；do：053962/jissn.40552200.252001039 Study on the model of chronic heart failure induced by adriamycin in rats

ZHANG Yi-Xin,JI Feag-Lan,WANG Xin,f al・

Changchun University of Traditional Chinesn Medicine,Changchun1211,Jilin,China

[Abstract h Objective Ta estab/sh a moPci of chrosic heart failure induced bp ab/amycik anO to stanOaOize the evaluatios index of the mohei.Methodt Wistar rats were OivideO into three gyups,each gyup was OiviOeO into blank gyup(A,D,G),mohei gyup(B,E,H),anO positive drup(/,F,I).Af

ter the start of the expe/oeot：ayup B anO ayup/were intrape/toseally injected with ab/amycik-.3mg/kg twice a weed far0cossecutive weeds,while group A was intraye/pseally injected with3ml/kg oormai salike of the same volume.Group/was giveo4.83g/kg qi/qiapyxio caysulo osce a Oap far73cossecutive Oays.Group A anO group

B were giveo3ml/kg of Uisk/ed water of the same volume；Group E anO gohp F were inWaye/Osevlly injected with ab/amycik

6.4mg/kg osce a weed far4weeds,while group D was intraye/pseally injected with3ml/kg oormai salike of the same volume. Group F was giveo4.33g/kg qi/qianyxio caysulo osce a Oap far0-cossecutive Oays.Group D anO goup E were giveo3ml/kg of Oisk/ed water of the same volume.Ad/amycio was intrape/toseally injected into group H anO group I at3. 4mg/kg osce a weed far8 cossecutive weeds.Meanwh/e,14ml/kg of oormai salioc of the same volume was inWaye/Osevll y injected into group G.Goup I was giveo4.83g/kg qi/qiapyxio capsule osce a Oap far50cossecutive Oays.Group g and group H were giveo3ml/kg of Oisk/ed water of the same volume.After the eod of the expe/oeot,the survival op,carOiac fuoctios,carOiac weight OUex,pathological changes of myocarOial tissue anO myocarOial cell apopPsis were ohseyeO.The costeot of B-ppe oatriuretic peptiUe(BNP/was OePcPd bp ELISA,anO the pypiu expyssioss of Caspase3,Bex anO BT-0were Oe

tecpd bp Western blot.Resnlts The survival rates of rats io the3.4mg/kg group were higher thao those iu the1.3mg/kg and6.4mg/kg groups.CompareU with the costrai group,LVSP，土dp/ Ot Mcx anO carUiac weight index iu the3.4mg/kg mohei group were sionificaptly lower(P<14-ar P<<.45/,while BNP costext was sionifican/y higher(P<4.4-/:The myocardium was pathologically Uamaaed.The thichoess of left vextocular myocarUial wall was sig)

基金项目：国家重大新药创制专项(2618ZX60711061-960-965)

通信作者：徐惠波(365-)，女，主任药师，硕士生导师，主要从事中药基础及应用开发研究。

第一作者：张译心(394-)，女，硕士在读，主要从事动物模型的制备研究。

nificaztly decreased(P<2.6)1,myocardial apopmsis0©乂was siynifican/y iocoased(P<2.2)),the expossCos of cardiac tissue proteios Caspase3and Bo were iocoased(P<2.H1,and the expossioo of Bcl-0was decreased(P<2.H),which promoted the apoptosis of myocardial cells.By positive druu qiCqianyxiu capsule Deatmext,compared with the mobei youp,the test indicators haO beex siynificazhy improved.Conclusions SwOW azimai mobels of chrooic heart failure were popaon by inDape/mpeal injeckoo of UoxoruUiciu3.6ms/0g ooce a weed for8weeds.The mobei could be evaluated objectively by detecting cardiac funckoo,cardiac mass 匚(0乂，BNP coxtext and myocardi

al pathologicai chazyes.

【Key words]DoxoruUiciu;Chrooic heart failure；Cardiac fuoctiox;Cardiac indey

慢性心力衰竭（CHF）常见于各种心血管疾病的终末期阶段，是一种具有高患病率和高死亡率的临床常见病⑴。阿霉素（ADR）属于蔥醌类药物，是临床常用的一种高效肿瘤化疗药物，长期使用可损害机体的心肌组织，具有严重的心脏毒性，引发剂量依赖性不可逆的心肌损害和CHF2"〕，因此ADR致大鼠CHF动物模型已经成为基础研究中常采用的动物模型。虽然该模型应用的文献报道很多，但方法不一，多种多样，也无统一的评价标准，本实验通过采用ADR不同的造模方法，建立稳定的大鼠CHF 模型，并以CHF的阳罠苈强心胶囊对造模结果进行验证，旨在建立一种稳定可重复的ADR诱导CHF动物模型，并规范模型评价指标，为该模型在药理学研究中更好应用提供方法学依据。

1材料与方法

1.1药物与试剂ADR：批号：2703E3、1909E2，由深圳万乐药业有限公司经销；罠苈强心胶囊：批号: A207004，由石家庄以岭药业股份有限公司经销。

注射用生理盐水购自吉林康乃尔药业有限公司；乌来糖购自国药集团化学试剂有限公司；肝素钠购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；甲醛购自天津市北联精细化学品开发有限公司；甲醇购自北京

化工厂；二喹咻甲酸（BCA）总蛋白定量测试盒购自南京建成生物工程研究所;B型利钠肽（BNP）、酶联免疫吸附试验（ELCA、试剂盒购自RD公司；RIPA、十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）上样缓冲液、T/s液、TBST均购自康为世纪生物科技有限公司；GAPDH（G-9）IgG2、B细胞淋巴瘤（Bel）-0（CD/IgG2、Bci-0相关X蛋白（Boe）（B-2）1gG2b>Casyasa-3（C-0）1gG0o均购自Santo Cruz公司；TUNEL试剂盒购自美国Rocha公司。

1.2动物健康7周龄SPF级WCtar大鼠，雌雄均可，体重（220±20）g，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司J SCXK（吉）D016D003〕，饲养于吉林省中医药科学研究院屏蔽环境动物室〔SYXK（吉）2015-0009〕，本实验经过吉林省中医药科学院动物伦理委员会批准实施，伦理审批号JLSZKYD-WLL2017D02。nano3

1.2仪器多导生物记录仪（AD仪器公司产品），酶标仪（BcTed仪器有限产品、，紫外分光光度计（上海元析仪器有限公司产品），高速冷冻离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司产品），六一电泳仪（北京市六一仪器厂产品），Imager（U/ro-EioWi PoPucis LW产品），石蜡切片机及石蜡包埋机（德国Leicu公司产品），光学显微镜（日本Olympus公司产品），图像分析系统（日本NIKON公司产品）。

1.2造模与分组WCtar大鼠150只，试验分3批进行，每批均分空白组、模型组、阳组，随机分组，共计9组。具体分组、造模及给药方法如下：第一批,ADR注射量为

2.0mg/kg：试验分为空白组（A组）17只，模型组（B组）24只，阳组（C 组）24只。试验开始后B组、C组腹腔注射ADR 2.0mg/kg，次/w，连续9w,A组同时腹腔注射同体积生理盐水17mWkg;C组灌胃罠苈强心胶囊0.37g/kg,《次/d，连续47d,A组和B组同时灌胃同体积蒸馏水2ml/0go

第二批,ADR注射量为0.0mg/kg：试验分为空白组（D组）10只，模型组（E组）25只，阳组（F 组）24只。试验开始后E组、F组腹腔注射ADR 0.0mg/kg,I次/w，连续18w,D组同时腹腔注射同体积生理盐水17mWkg;C组灌胃罠苈强心胶囊0.37g/kg,I次/d，连续92d,D组、E组同时灌胃同体积蒸馏水10mWkgo

第三批,ADR注射量为7.0mg/kg：试验分为空白组（G组）13只，模型组（H组）24只，阳组（组）24只。试验开始后H组、、组腹腔注射ADR 3.0mg/kg,I次/w，连续8w,G组同时腹腔注射同体积生理盐水17mWkg；I组灌胃罠苈强心胶囊0.37g/kg,2次/d，连续56d,G组、H组同时灌胃同体积蒸馏水10mWkgo

1.2存活率计算各组记录初始动物数，试验结束后记录各组存活动物数，计算各组动物的存活率。1.2心功能检测末次给药后30min，各组随机选取2只大鼠，称重，腹腔注射乌来糖（

2.2g/kg、2mWky）麻醉，仰卧固定，右侧颈总动脉插管经压

力换能器接生理记录仪，记录心率、收缩压（SBP）、

舒张压（DBP）后，继续将导管插至左心室，记录左心室收缩末期压力（LVESP）、左心室舒张末期压力（LVEDP）、左心室内压最大上升/下降速率（土dy/dt muc）°

1.2心脏指数测定心功能检测结束后，去除腹腔内腹水后再次称重，计算腹水重量=体重-去腹水体重；取心脏，去除非心肌组织，洗净血液，滤纸吸干水分，称全心重量。计算心脏指数（HW/BW）=全心重量/体重。

1.2心肌组织中BNP含量检测每组随机选取1只大鼠，腹主动脉取血，经8000Omic离心17min，分离血清，-80%：保存备用。ELISA检测血清中BNP的含量。

1.2心肌组织苏木素-伊红（HE）染观察每组随机选取若干只大鼠，摘取心脏，称重后，将部分心肌组织固定于1%甲醛溶液中,HE染，光镜下心肌细胞形态学观察，并测量心室壁厚度°

1.10心肌组织凋亡率检测各组随机选取8只大鼠，摘取心脏，将部分心肌组织固定于12%甲醛溶液中，进行TUNEL染，观察心肌细胞凋亡情况，计算凋亡率。

1.11心肌组织中相关蛋白的检测动物采血后，取部分心肌组织,-80%保存备用，通过Wekeo印迹分析心肌组织中凋亡信号通路蛋白Casyase3、BapBciA表达的变化。

1.12统计学方法采用SPSS2

2.9软件统计进行t 检验。2结果

2.1ADR致大鼠CHF对存活率的影响A组存活率为10%（12/1）,D组存活率为01.07%（11/ 2、，G组存活率为10%（18/18）；C组存活率为62.5%（17/20），组存活率为62.5%（17/20）,1组存活率为91.7%（22/24）；B组存活率为70.58%（17/24）,E组存活率为6&00%（17/25）,H组存活率为37.90%（21/24），即模型组存活率：H组>B 组〉E组，说明8.0my/hy剂量组模型的制备动物存活率较高。

2.2ADR致大鼠CHF对心功能的影响ADR 1.9mghy组：与A组相比，B组心率、SBP显著下降，-dy/dt muc有降低趋势，LVEDP显著升高（P< 0.01）,LVESP、+dy/dt muc显著降低（P<0.01）；与B组相比，C组心率、SBP、LVESP均显著升高（P< 0.01；P<0.05）°

ADR2.0my/ky组：与D组相比,E组SBP和LVESP显著降低（P<0.01；P<0.05）,LVEDP显著升高（P<0.05）,DBP有升高的趋势，土dy/dt muc有降低趋势（P>0.05）；与E组相比，F组SBP、DBP、LVESP、土dy/dt max均显著升高（P<0.01,P<0.05）, LVEDP显著降低（P<0.05）°

ADR/0my/hy组：与G组相比,H组LVESP、土dy/dt max均显著降低（P<0.01；P<0.05），心率有降低的趋势，DBP和LVEDP有升高的趋势（P> 0.05）；与H组相比6组心率和LVESP显著增加（P<0.05），土dp/dt muc增加（P<0.05），见表1°

表1ADR致大鼠CHF对心功能的影响（亍=2）

组别LVES P mmHgs)LVEDP(mmHgs)+dp/5-muc(mmHgs)-dp/5-muc(mmHgs-心率（次/min-SBP(mmHg-DBP(mmH/

/组160.00±17.20-22.42±5.217554.58±e44.98-5229.15±969.56382.00±53.8138.38±1.918.66±18.72 B组12.68±15.067-15.22±8.561162/6.07±1137.827-4453.47±91.197339.30±42.067125.77±1.8/138.66±20.83 159.18±18.7153-12.11±7.12698.01±1426.82-4944.87±696.1391.61±33.278314.64±12.675399.47±18.48外包培训

D组172.95±)5.35-12.43±7.275905.59±955.65-4985.49±388.82363.17±48.79146.34±1.9285.17±21.1 E组152.41±9.1953-8.20±7.47/35798.2/±1110.77-4603.61±912.0/372.92±33.12154.07±7.49/392.52±1.38 F组181.34±15.0143-17.25±12.05736974.02±1340.0373-5598.75±584.173341.59±38.98129.27±12.3973115.02±12.6973 G组171.54±22.03-14.20±12.0714765.23±4604.47-9985.60±3331.39358.27±56.4712.93±1.7589.95±1.29 H组19.02±20.7793-9.32±9.7488/5.14±2739.0293-6295.41±1755.3063334.31±67.15159.17±23.5511.69±29.12 I组12.38±9.01173-8.98±11.591954.8±4300.00173-8905.8±3060.8173392.57±55.34173148.38±11.2712

7.97±1.08与A组比较：1)P<0.91；与B组比较：2)P<0.05,3)P<0.01；与D组比较：4)P<0.05,5)P<0.01；与E组比较：6)P<0.05,7)P<0.01；与G组比较/)P<0.05,9)P<0.91；与H组比较：1)P<0.05,11)P<0.91，表2，表5同

2.3ADR致大鼠CHF对心脏重量及心脏指数的影响ADR1.9mghy组：与A组相比,B组体重和心脏重量均显著降低（P<0.01），腹水重量和心脏指数有增加的趋势（P>0.05）；与B组相比,C组体重有升高的趋势（P>0.05）°ADR2.0mghy组：与D 组相比,E组体重和心脏重量显著降低（P<0.01），腹水重量显著增加（P<0.01）（与E组比较,F组大鼠体重有降低的趋势（P>0.05）O ADR8.0my/hy

组：与G组相比，H组体重、心脏重量、心脏指数均显著降低（Pv2.2）;Pv2.25），腹水重量显著增加（Pv2.22）；与H组比较《组大鼠体重、心脏重量及心脏指数均显著增加（Pv2.2）;Pv2.25），腹水重量显著降低（Pv2.42），见表0o

2.4ADR致大鼠CHF对血清BNP含量的影响ADR）.5mg/gg组：空白组与模型组比较无显著差异（P〉2.25），与模型组比较，阳组BNP含量显著降低（PV2.2））。ADR2.4mg/kg组：与空白组比较，模型组BNP含量显著升高（P<2.4））；与模型组比较，阳组BNP含量显著降低（PV2.25）。ADR

3.4mg/kg组：与空白组比较，模型组BNP含量显著升高（P<

4.42）；与模型组比较，阳组BNP 含量显著降低（P<2.42），见表3o

表0ADR致大鼠CHF对心脏指数的影响（丘土s,=12）组别体重（g）心脏重量（g）腹水重量（g）心脏指数（％）A组543.42±27.30).21±2.26 2.92±3.63 2.107±2.089 B组207.22±35.0)2) 2.71±2.21128.82±22.26 2.239±2.220 C组32).28±33.42 2.77±2.1)27.63±12.22 2.242±2.216 D组553.34±42.42).27±2.1) 2.25±3.07 2.232±2.217 E组203.93±25.296) 2.65±2.080)32.63±12.406) 2.222±2.217 F组275.2±32.75 2.61±2.0827.31±15.63 2.222±2.215 G组345.91±24.42 2.96±2.27 6.13±).58 2.32±2.222 H组216.65±12.260) 2.43±2.270)2).03±8.3)9) 2.292±2.22581 I组234.69±l).78n)2.76±2.O812) 2.53±3.8612)2.322±2.232171

表9ADR致大鼠CHF对血清BNP含量及左心室壁厚度的影响（x±^,=14,pg/ml）

组别

BNP(pg/ii)左心室壁厚度（pjn）

1.5ig/kg

2.2is/kg

3.2is/kg 1.5ig/kg 2.2ig/kg 3.2is/kg

空白组925.02±135.46822.52±92.33425.78±4).9)3152.63±529.252933.52±419.422242.47±257.3)模型组840.32±22.281128.22±92.204175).92±62.15412355.44±227.492)2322.24±185.4911617.32±252.3841阳组749.52±92.8791974.52±137.6771613.43±32.36911617.32±252.382215.53±367.161798.29±162.230)与空白组比较：1）P<2.259）P<2.2）；与模型组比较：3）P<2.259）P<2.2），表4同

12ADR致大鼠CHF对左心室壁厚度的影响

ADR）.5mg/kg组：与空白组比较，模型组左心室壁

厚度降低（PV2.25）。ADR0.4mg/kg组：与空白组

比较，模型组左心室壁厚度显著降低（PV2.21）;

ADR3.4mg/kg组：与空白组比较，模型组左心室壁

厚度显著降低（P<4.42）；与模型组比较，阳组

左心室壁厚度显著增加（Pv2.25），见表3o

19ADR致大鼠CHF对心肌组织形态学的影响

HE染结果显示：ADR）.5mg/kg组：A组心肌

细胞排列紧密，心肌间质可见轻微水肿、疏松;B组

心肌细胞体积变小，左心室壁厚度明显变薄，心肌间

质可见水肿;C组大鼠左心室壁变薄，心肌间质疏松

区域减少。ADR0.4mg/kg组：D组可见局部少量

心肌间血管充血;E组左心室壁变薄，心肌间质可见

明显水肿、疏松;F组大鼠左心室壁变薄，心肌间质

水肿、疏松程度减轻。ADR3.2mg/kg组:G组心肌

纤维排列规整，细胞核多位于肌纤维中央，心肌间质未见渗出、未见水肿，心肌内血管未见扩张充血，心内膜、外膜亦未见炎细胞浸润；H组心肌细胞变性、水肿；心肌间质间隙扩大；心肌纤维染不均；左心室壁厚度明显变薄，左心室腔变大；乳头肌处心肌纤维变性明显，呈典型的心肌病改变，

心外膜可见炎细胞浸润;）组心肌典型的心肌病改变，心肌细胞变性、水肿；心肌间质间隙扩大；血管扩张，心肌纤维染不均的程度有所减轻，见图）o

C组F组I组

图1ADR致大鼠CHF对心肌组织形态学的影响（HE,x204）

2.7ADR致大鼠CHF对心肌组织凋亡指数的影响分别与各自空白组比较，ADR）.5、2.2、

3.2mg/kg模型组心肌细胞凋亡指数均显著升高（P<2.2）;Pv2.25）；与模型组比较,）.5mg/kg阳组心肌细胞凋亡指数有降低趋势（P〉2.25）,0.2、3.2mg/kg

阳组心肌细胞凋亡指数显著降低

（Pv4. 45 ）o TUNEL 染显示，ADR -.5 mg/kg 组：A 组凋

亡细胞数较少，凋亡阳性细胞呈深棕;B 组深棕凋亡阳性细胞散在分布在未凋亡的心肌细胞间；C

组可见极少见的呈深棕黄阳性染的细胞分布在正常心肌细胞间，观察视野内凋亡阳性染细胞数量极少；ADR 6. 4 mg/kg 组:D 组散在分布的深棕

凋亡阳性细胞数较少;E 组可观察到视野内呈深棕凋亡阳性细胞分布增加；F 组可见数个呈深棕黄

阳性染的细胞分布，观察视野内凋亡阳性染细胞数量减少;ADR3.4 mg/kg 组:G 组可见极少见

的呈深棕黄阳性染的细胞分布在正常心肌细胞间，观察视野内凋亡阳性染细胞数量极少;H 组可

见数个呈深棕黄阳性染的细胞分布，观察视野内凋亡阳性染细胞数量增加6组可见数个呈深

棕黄阳性染的细胞分布，观察视野内凋亡阳性染细胞数量减少，见表4、图6o

表4 ADR 致大鼠CHF 对心肌组织细胞

凋亡指数的影响= 1）

组别 1. 5 mg/kg

2. 4 mg/kg

3. 4 mg/kg 空白组 2. 41 ±2. 47 2. 29 ±2. 44

4. 92±4. 4

模型组

4. 22±-.921-

4. 96±4. 776 -

4. 51 ±2. 252 -阳组 3.56±0 25

3.55±

4. 738)

2. 11±1.758 -

A 组

D 组

涉日

G 组

1 C 组 F 组

I 组

图-阿霉素致大鼠CHF 对心肌组织凋亡的

影响（TUNEL 染，x2（M ））

/ :

B 组 E 组

H 组上海铁路医院

•

1«

胫骨前肌

■

2 2 ADR 致大鼠CHF 对心肌组织凋亡相关蛋白表达的影响 ADR -. 5 mg/kg 组，与A 组比较,B 组

Bcl-9显著降低，Bax 、Caspasc-3显著升高（均P <4.45）；与B 组比较，C 组Bcl-9组显著升高（P<

4.1） ,Bax 显著降低（Pv4. 45）。ADR 0.4 mg/kg 组，与D 组比较,E 组Bcl-9显著降低,Bgp A Casyasc-

3显著升高（均PV4. /-）；与E 组比较,F 组Bci-2显

著升高（Pv/./l ） ,Bax 显著降低（PV4.45）。ADR 3 . 4 mg/kg 组，与 G 组比较，H 组 Bax A Caspasc-3 显

著升高,Bcl-9显著降低（均P<4. 45）；与H 组比较,

I 组Bci-2显著升高（Pv/./l ） ,Bax 显著降低（P<4.45） :Casyase-3 有降低趋势（P>4. 45 -，见图 3、

表 5 。

与空白组相比：-）P<4. 45,2）P<4. 44与模型组相比：3）P<2. 45,4） P<4.1

图9 ADR 致大鼠CHF 对心肌组织凋亡