-基础研究-
重构的影响
胡菱孟林凤胥亚楠裴赫男王茜胡华刚赵冬琰刘梅洁
【摘要】目的：探讨有氧运动(AE)对充血性心力衰竭(CHF)大鼠心室肌细胞钾通
道重构的作用及机制。方法：将SD大鼠随机分为假手术组、CHF组、假手术+AE组、 CHF+AE组。建立CHF及假手术大鼠模型后，4组大鼠先进行适应性训练1周，假手
术组、CHF组进行一般照护8周，假手术+AE组和CHF+AE组给予AE干预8周。各
组饲养及训练结束后行超声心动图检测左室射血分数(LVEF)及左室后壁厚度
国家节能中心(LVPWD),HE染、天狼星红染检测心肌组织形态学及纤维化程度，计算左室质量
指数(LVWI)，定量分析N末端脑钠肽前体(NT-proBNP)水平，实时荧光定量聚合酶链
反应检测快速激活延迟整流钾电流(IKr)编码基因KCNH2及慢激活延迟整流钾电流
(IKs)a亚基编码基因KCNQ1的mRNA表达水平,Western blot检测KCNH2和 KCNQ1蛋白表达水平。结果：与假手术组比较，CHF组大鼠心肌组织损伤严重，
LVEF明显降低，LVPWD、LVWI及NT-proBNP水平均明显升高；与CHF组比较，
CHF+AE组大鼠心肌组织损伤明显减轻，LVEF明显升高，LVPWD、LVWI及
NT-proBNP水平均明显降低(P均＜0.05 )。与假手术组比，CHF组KCNQ1及
KCNH2的mRNA表达水平均明显上调；与CHF组比，CHF+AE组KCNQ1及
KCNH2的mRNA表达水平均明显下调(P均＜0.05)。与假手术组比，CHF组
KCNQ1及KCNH2的蛋白表达水平均明显下调；与CHF组比，CHF+AE组KCNQ1
及KCNH2的蛋白水平均明显上调(P均＜0.05)。假手术组与假手术+AE组各指标差
异无统计学意义。结论:AE参与调控CHF大鼠心肌结构与IKr、IKs离子通道重构。
【关键词】充血性心力衰竭；心室重构；有氧运动；延迟整流钾离子通道
doi：10.3969/j.issn.16736583.2021.03.010
Effects of aerobic exercise on remodeling of potassium channel in ventricular myocytes from rats with heart
failure HULing1,MENG Linfeng1,XUYa犪狀,PEI Henan1,WANG Qian1,HUH犪gag,
ZHAO Dongyan1,LIU Meijie2.1.Beijing Xiaotangshan Hospital,102211Beijing；
2.Experimental Research Center,China Academy of Chinese Medical Sciences,100700
Beijing,China
【Abstract】Objective：To investigate the effects and mechanism of aerobic exercise(AE)on
remodeling of potassium channel in ventricular myocytes from rats with congestive heart failure(CHF).
Methods:SD rats were randomly divided into sham operation(SO),CHF,SO+AE and CHF+AE
groups.A ll the rats took aerobic training for one week.The rats in SO and CHF groups were given
regular feeding for8weeks then,while the rats in SO+AE and CHF+AE groups were given
基金项目：北京市医院管理局临床医学发展专项经费(ZYLX201835)；北京市自然科学基金(7192242)
作者单位=102211北京小汤山医院(胡菱，孟林凤，胥亚楠，裴赫男，王茜，胡华刚，赵冬琰)100700北京，中国中医科学院动物实验中心(刘梅洁)
通信作者：胥亚楠,E-mail:282984303@qq
corresponding intervention after modeling.Lett ventricular ejection fraction(LVEF)and left ventricular posterior wall thickness(LVPWD)were examined by echocardiography.HE staining and Sirius red staining were used to detect myocardial histomorphology a nd fibrosis.And the left ventricular mass index(LVMI)were calculated.N-terminal pro-brain natriuretic peptide(NT-proBNP)levels were measured.The mRNA levels of KCNH2and KCNQ1were detected by real-time PCR,which were the encoding gene of rapidly activating delayed rectifier K+current(IKr)and a subunits of slowly activating delayed rectifier K+current(IKs),respectively.Expression levels of KCNH2and KCNQ1protein were detected by western b lot Results:Compared with SO group,the rats in CHF group had severer myoc
ardial injury,LVEF decreased significantly,and LVPWD,LVWI and NT-proBNP levels increased significantly.Compared with CHF group,the myocardial injury alleviated in CHF+AE group,with higher LVEF,lower LVPWD,LVWI and NT-proBNP levels(a ll P V0.05).Compared with SO group, the mRNA expression levels of KCNQ1and KCNH2in CHF group were significantly up-regulated. Compared with CHF group,the mRNA expression levels of KCNQ1and KCNH2in CHF+AE group were significantly decreased(all P V0.05).Compared with SO group,the protein expression levels of KCNQ1and KCNH2in CHF group were significantly decreased.Compared with CHF group,the protein levels of KCNQ1and KCNH2in CHF+AE group were significantly increased(a ll P V0.05). There was no statistically significant difference between SO group and SO+AE group.Conclusions: Aerobic exercise is involved in the regulation of myocardial structure and IKr,IKs ion channel remodelinginratswithheartfailure
【Key words】Congestive heart failure；Ventricular remodeling；Aerobic exercise；Delayed rectifier potassiumchannel
充血性心力衰竭(CHF)是多种心血管疾病进展的终末阶段，约50%的患者死于恶性心律失常［1］，而恶性心律失常发生的主要机制是心肌细胞电重构。心肌细胞离子通道重构是心肌细胞电重构的重要基础。多项研究表明，适量有氧运动(AE)能够显著改善心血管内皮功能，提高受试者运动耐力，降低交
感神经兴奋性，抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)的活动，从而显著改善心肌缺血及缺氧状况。但AE对心室肌细胞离子通道重构的作用尚未明确。延迟整流钾电流(IK)是心室肌细胞复极的主要电流之一，本研究建立CHF大鼠模型，通过AE干预，观察快速激活延迟整流钾电流(IKr)编码基因KCNH2及及慢激活延迟整流钾电流(IKs)a亚基编码基因KCNQ1的表达水平，探讨AE在CHF中的作用及病理生理机制。
1材料与方法
1.1实验动物与材料
12周龄清洁级SD大鼠48只，体质量(240士25)g，由中国中医科学院医学实验中心动物部提供。天狼星红染液购自海德创业生物科技有限公司，苏木精-伊红染液购自北京博润莱特科技有限公司，大鼠N末端脑钠肽前体(NT-ProBNP)酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉菲恩生物科技有限公司，miScript SYBR®Green PCR Kit购自Thermo公司,TRIzol reagent购自Invitrogen公司，兔抗大鼠KCNH2抗体、兔抗大鼠KCNQ1抗体购自Creative Diagnostics公司。
1.2CHF模型建立及实验分组
SD大鼠随机分为假手术组、CHF组、假手术+ AE组和CHF+AE组，每组12只。SD大鼠禁食12h，称
量体质量，腹部脱毛后采用10%水合氯醛(0.3mL/100g)腹腔注射麻醉大鼠,CHF模型建立参照参考文献［］。将大鼠仰卧固定，消毒后沿剑突自腹中线略偏左侧垂直切开腹部皮肤，钝性分离腹主动脉及左肾动脉。用4号手术缝线于左肾动脉上方约1.0cm处结扎腹主动脉，使腹主动脉狭窄约80%［腹主动脉直径约(1.76士010)mm］，逐层缝合。假手术组于腹主动脉下放置手术缝线但不结扎,CHF组结扎腹主动脉，两组大鼠手术1周后，先进行适应性游泳1周，再进行一般照护8周。假手术+AE组及CHF+AE组采取无负重游泳训练，在120cmX80cmX70cm的长方形塑料水桶中进行，水桶四壁光滑，水深约40cm，水温(32.0士2.5)C，每天游泳运动1次，每次20min，两组大鼠手术1周后，先进行适应性游泳1周，再进行AE训练8周。
1.3心功能指标测定
各组饲养及训练结束后，采用VisualSonics770超声,17.5MHz探头测定SD大鼠的左室后壁厚度（LVPWD）及左室射血分数（LVEF）。取大鼠内眦静脉血冰上静置2h,3000转/min离心15min，取上清液，用ELISA试剂盒测定血浆中NT-proBNP 含量。使用过量10%水合氯醛将大鼠处死，摘取心脏，分离心房，剪去右心室游离壁，称量左室质量，左室质量指数（LVWI）=左室质量/大鼠体质量。1.4HE染及天狼星红染检测心室肌组织形态及纤维化程度
将心室肌组织用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，进行HE染和天狼星红染。
1.5实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测KCNQ1和KCNH2的mRNA表达水平
使用Trizol Reagent提取各组心室肌细胞总RNA。大鼠KCNQ1上游引物为5'-CGCCTCCTG TTTCTCTGTCT-3'，下游弓|物为5'-CGTCTTCGT CTCCGTCTTTG-3'。大鼠KCNH2上游引物为5-ACCCACAATGTCACCGAGAAG3'，下游引物为5'-CCTGACCGAGTAAGACGAC3'。GAPDH 上游引物为5'-GGTGCTGAGTA TGTCGTGG AGT-3'，下游引物为5'-TAGTGACGGTGGGTCT TCTGA3'。反应条件为95C预变性10min,95C 变性30s,60C退火30s,72"C延伸30s,40个循环。以2—z计算KCNQ1和KCNH2mRNA的相对表达水平。
1.6Western Blot检测KCNQ1和KCNH2的蛋白表达水平
提取各组心室肌细胞总蛋白，使用BCA法测定蛋白浓度。取60遽总蛋白上样，行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），电泳后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上，用5%脱脂牛奶室温封闭1h，加入KCNH2、KCNQ1—抗,4C孵育过夜，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育1h。充分漂洗后显影、摄片并进行条带灰度定量测定。以GAPDH作为内参，利用ImageJ软件对条带进行半定量分析。
1.7统计学分析
统计分析采用Graphpad Prism6软件。计量资料以均数士标准差表示，采用单因素方差分析进行多组间比较。P V0.05为差异有统计学差异。
2结果
2.1各组心功能指标比较
与假手术组相比,CHF组的LVEF显著降低, LVPWD.LVWI及NT-proBNP水平均明显升高（P 均＜0.01）；假手术+AE组与假手术组的心功能指标差异均无统计学意义。与CHF组相比,CHF+AE 组LVEF明显升高,LVPWD、LVWI及NT-proBNP 水平均明显降低（P均＜0.01）。见表1。
表1各组大鼠LVEF、LVPWD、LVWI、NT-proBNP检测结果比较项目假手术组CHF组假手术+AE组CHF+AE组
LVEF60.83±21740.50±1.73⑴6200±17953.33±208(> LVPWd0.12±0010.20±0.01⑴011±0010.16±0.01(2 LVWI011±0010.19±0.01⑴012±0010.15±0.01(2 NT-proBNP40940±17.9977680±17.67⑴45760±1184505.20±12.81()
注：与假手术组相比,（＞p＜0.01；与CHF组相比,2＞P＜0.01
2.2各组心室肌组织形态学及纤维化程度比较
HE染结果显示，假手术组、假手术+AE组心肌细胞形态正常，排列整齐;CHF组可见心肌细胞明显肥大、水肿，部分心肌细胞呈脂肪样变性，出现间质充血及纤维排列紊乱,CHF+AE组的上述情况较CHF组减轻。见图1。
天狼星红染可显示心肌间质及血管周围胶原分布情况。假手术组、假手术+AE组成纤维细胞未见明显增殖，细胞排列整齐;CHF组成纤维细胞增殖，胶原累积，皿型胶原增多，细胞外基质沉积,CHF+AE组的上述表现较CHF组明显好转。见图1。
2.3各组心室肌细胞KCNH2和KCNQ1表达水平比较
与假手术组相比,CHF组KCNQ1和KCNH2的mRNA表达水平均明显上调（P均＜0.05）假手术+AE组与假手术组KCNQ1和KCNH2mRNA 表达水平的差异均无统计学意义。与CHF组相比,CHF+AE组KCNQ1及KCNH2的mRNA表达水平均明显下调（P均＜0.05）。见表2。
与假手术组相比,CHF组心室肌细胞KCNQ1及KCNH2蛋白表达水平明显下调（P均＜0.05）；
CHF 组相比,CHF+AE 组 KCNQ1 及 KCNH2 蛋
白表达水平明显上调（P 均<0.05）。见图2、表2。
假手术+AE 组与假手术组心室肌细胞KCNQ1及
KCNH2蛋白表达水平的差异均无统计学意义。与
图1各组大鼠心肌组织形态学及纤维化程度
表2各组KCNH 2和KCNQ 1的mRNA 和蛋白表达水平比较
组别
KCNQ 1
KCNH 2
联想et980mRNA 表达水平
蛋白表达水平
mRNA 表达水平
蛋白表达水平
假手术组 1.29±0. 34
083±004
1. 37 ±0 19
100±012CHF 组
4. 98±0. 99 ⑴0.56±0. 08⑴
5. 22 ±0.65 ⑴0.41 ±0. 11 ⑴假手术+ AE 组
1.92±0. 29084±011
083±023
084±0045CHF + AE 组 1.95±0. 39 ⑵
0. 80±0 03 ⑵ 1. 85 ±0.12 ⑵
0. 96 ±0.21 ⑵
注：与假手术组相比,（1） P <0. 05 ；与CHF 组相比,P <0. 05
图2各组KCNQ1及KCNH2蛋白表达情况
3讨论
心室重构包括结构重构及电重构，是CHF 的 重要病理生理机制囱。RAAS 是导致心室结构重
构的重要因素。NT-proBNP 能对抗RAAS 引起的 水钠潴留，可扩张血管，增加排钠，有较好的稳定 性，是评价CHF 的敏感性及特异性指标。研究证
实,AE 可以改善CHF 患者的心肺耐力，降低
NT-proBNP 水平，改善患者的心功能期。本研究 成功建立了 CHF 大鼠模型，发现接受AE 的CHF
大鼠的LVEF 较未接受AE 的CHF 大鼠升高，
LVWI 、NT-proBNP 水平降低，表明AE 可改善心
室射血功能，抑制CHF 所致心室重构，同时能够对
抗RAAS 引起的水钠潴留，降低NT-proBNP 水平。
另外，本研究发现，接受AE 的CHF 大鼠心肌细胞 水肿、增大、脂肪变性、间质充血等病理改变较未接
受AE 的CHF 大鼠有所减轻，表明AE 对CHF 大
鼠心肌细胞凋亡有改善作用。这与文献报道AE 能
显著改善CHF 大鼠的心功能、减轻心肌纤维化 一致2。
IK 具有外向整流的特点，包括3种亚型，分别 为超快激活电流（IKuC 、IKr 和IKs，大鼠心室肌细
胞仅有后2种电流，其改变可导致功能衰竭的心室 肌细胞发生快速室性心律失常。研究表明，在CHF
大鼠发生室性心律失常时，存在IK 及IKs 减小，动
作电位持续时间（APD ）显著延长]1113] o 本研究检
测大鼠心室肌IKr 及IKsp 亚基的编码基因
KCNH 2 和 KCNQ 1，发现 CHF 大鼠 KCNH 2 和 KCNQ1的mRNA 表达水平明显上升，接受AE 后KCNH 2和KCNQ1的mRNA 表达水平明显下
降，而CHF 大鼠KCNQ1及KCNH2的蛋白表达水
平明显下调。转录和翻译是两个不同的过程，在某
些特定的条件下可以脱节，翻译过程中，mRNA 可
能会受到其他因子的负调控。这与文献报道CHF 大鼠在发生室性心律失常时KCNH2和KCNQ1蛋白表达受抑制结果一致[14]。
综上所述，本研究结果显示，AE参与调控CHF大鼠心肌结构与IKr、IKs离子通道重构,AE 可改善心肌结构重构，逆转心肌电重构中IK离子通道的改变。该研究为临床运用AECHF、改善CHF预后提供一定理论基础。
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(收稿:2020-07-09修回:2021-02-02)
(本文编辑：胡晓静)
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