文章编号:1674－7054(2014)02－0170－
04
秦垂新，曹子丰，谭丽容，林伟斌
(无限极(中国)有限公司，广东江门529156)
摘要: 以无限极增健口服液为原料，利用CTAB 沉淀法分离制备口服液的中性和酸性多糖，并对其进行定
量分析。结果表明，该口服液多糖的各单糖组分比例为m甘露糖∶m核糖∶m鼠李糖∶m葡萄糖醛酸∶m葡萄糖∶m半乳糖∶m木糖∶m 阿拉伯糖
=19． 9 ∶0． 9 ∶0． 9 ∶2． 6 ∶61． 0 ∶7． 4 ∶5． 2 ∶2．1。硫酸苯酚法检测结果表明，该口服液的中性多糖和酸性多糖，占总多糖的质量百分比分别为54． 3% ～67． 8% 和5． 9% ～11．8% 。本方法可为多糖分类的快
速检测提供参考。
关键词: 酸性多糖；中性多糖；中草药; 硫酸苯酚法；季铵盐沉淀法
中图分类号: Ｒ284 文献标志码: A
中药口服液是根据传统中医理论，从多种天然药食同源植物中提取免疫调节剂—复合多糖精制而成。多糖具有多种生理活性和营养价值，如预防糖尿病、降血糖、降血脂、增加冠状动脉血流量、增强机体免疫力、诱导肿瘤细胞凋亡、抗病毒、抗辐射等多种功效［1］。其中，酸性多糖是目前发现的分布和应用最广、制备和结构鉴定最复杂的一类生物活性多糖［2］，具有较强的免疫促进、抗病毒及抗氧化应激等作用［3 －4］。目前，普遍采用化学分析方法结合高效尺寸排阻谱等仪器来分析酸性多糖和中性多糖［3，5］。但是，同时快速检测复合多糖中的中性多糖和酸性多糖的方法还未见报道。因此，笔者建立了中药口服液复合多糖中酸性多糖和中性多糖的一种快速定量分析方法，旨在为多糖的质量控制提供参考方法。
1 1． 1 材料与方法
材料与仪器
材料供试的中药口服液由无限极(中国)有限公司提供，商品名为增健口服液。
1．1．
1
1．1． 2 试剂和药品十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、浓硫酸、苯酚、石油醚(Ⅱ)、φ=95% 乙醇、氯仿、正丁醇、双氧水、丙酮、乙醚(均购自国药有限公司)、葡萄糖(美国Si gm a-A l dr i c h公司)。
大型超市管理实验仪器恒温水浴锅(HH －6，江苏金坛市宏华仪器厂)、循环水式多用真空泵(SHB －Ⅲ，郑州1．1．
3
长城科工贸有限公司)、紫外分光光度计(SH I M A DZU UV －2550，日本岛津公司)、分析天平( 万分之一，日本岛津公司)。
1． 2 实验方法
1．2．1多糖的制备取100 mL 的增健口服液，加入0． 01 g 木瓜蛋白酶，60 ℃恒温水浴缓慢振荡2 h，冷却至室温。然后加入50 mL 的sevaga 液，在恒温振荡器上快速振荡20 m i n，将混合液体离心，取其上清液，再重复加入sevaga 液进行相应处理，直至相间无乳白絮状沉淀。然后加入φ= 30
% 的H2 O2 ，60 ℃水浴6 h。缓慢滴入无水乙醇，室温静置 3 h。离心取沉淀，加入丙酮于超声清洗器中洗涤，将离心后所得残渣用氮气吹干，称重、密封，冰箱中保存备用。准确称取精制后的多糖100 m g(10 批，每批次有3 个平行
收稿日期: 2014－ 05 －01
作者简介: 秦垂新(1963－)，男，李锦记健康食品集团高级副总裁，工程师，主要从事中药材的种植和检测研究． E-ma il:e l ena．tan@ i nf i n i tus-i nt．c o m
第 2 期
秦垂新等：中药口服液中性、酸性多糖的检测方法
17
1
样)，加水溶解，定容至 50 m L ，即配成质量浓度为 2 g ·L － 1
的多糖供试液，备用。
1． 2． 2 多糖样品的水解及 P MP 衍生
多糖样品的水解 精确称取多糖样品 10 m g ，置于安剖瓶中，加入 2． 0 mL 浓度为 2 m ol ·L － 1 的 1． 2． 2． 1
TFA 溶液，用酒精喷灯封口，置于 110 ℃ 烘箱中水解 5 h ，反应完成后冷却至室温，离心取上清液，减压蒸
干，用甲醇超声溶解，再旋干，重复处理 3 ～ 4 次除去残留的 TFA ，样品减压蒸干后备用。
PMP 衍生化［6］ 将上述多糖水解物复水并定容。准确量取 0． 2 mL 水解液置于 5 mL 具塞玻璃 1． 2． 2． 2 离心管中，依次加入 0． 2 mL 0． 5 m ol ·L － 1 的 PMP 甲醇溶液和 0． 2 mL 0． 3 m ol ·L － 1 的 NaOH 溶液，混匀， 70 ℃ 水浴反应 60 m i n ，冷却至室温，再加入 0． 3 m ol ·L － 1 的 H C l 溶液 0． 2 mL 中和；加氯仿至 2 m L ，离心移 除下层有机相，用氯仿重复萃取 3 次，收集水相并用水定容至 5 mL ，用 0． 22 μm 的微孔滤膜过滤后供 HPLC 检测。
HPLC 分析 谱柱为 C18(250 m m × 4． 60 m m ，5μ)，流动相 A 相为乙腈、B 相为磷酸盐缓冲液 1． 2． 3 (0． 05 m ol ·m L － 1 ，pH6． 74)，A 相和 B 相按照 V ∶82 的比例等梯度洗脱，流速为 0． 8 m L · ∶V = 18 A 相 B 相 m i n － 1 。检测器为紫外检测器，检测波长为 245 nm ，进样量
20μL 。 CTAB 沉淀法制备中性、酸性多糖 准确量取多糖供试液 10 m L ，以体积比为 2 ∶1 的比例加入 1． 2． 4 w = 5% 的 CTAB 溶液，搅拌均匀后，40 ℃ 静置 5 h ，离心，取上清液定容到 50 m L ，得到中性多糖供试液，备 用。沉淀物用 40 ℃ 热水洗涤 2 次后，加入 2 m ol ·L － 1
的 NaC l 溶液 10 m L ，搅拌均匀，60 ℃ 解离 6 h ，解离
液离心 10 m i n ，将离心后的上清液定容到 50 m L ，即得酸性多糖供试液，备用。 1． 2． 5 硫酸 － 苯酚法测定总多糖
1． 2． 5． 1 标准曲线溶液的制备 准确称取 105 ℃ 烘干至恒重的葡萄糖标准品 25 m g ，配制质量浓度为 1． 0 g ·L － 1 的葡萄糖标准溶液。吸取 1 mL 葡萄糖标准溶液，稀释 10 倍制得质量浓度为 0． 1 g ·L － 1 的葡 萄糖标准液，备用。准确量取 0． 5 mL 的葡萄糖标准液(0． 1 g ·L － 1
)，置于 20 mL 的具塞刻度试管中，用水 将体积补至 1 mL ，加 w = 5% 的苯酚溶液 1 m L ，涡旋混匀，然后沿试管壁缓慢加入 5 mL 的浓硫酸，摇匀， 静置 30 m i n ，同样配制相应的空白。用紫外分光光度计进行光谱扫描，扫描范围为 200 ～ 600 nm ，记录最 大吸收波长(λm ax )。
硫酸 － 苯酚法测定［2］
取 0． 1 mL 的待测样品液加入具塞试管中，加入 w = 5% 的苯酚溶液 2 1． 2． 5． 2 m L ，混匀，
缓慢加入 7 mL 浓硫酸，混匀，沸水浴 15 m i n ，取出，冰水冷却至室温，在 490 nm 处测定吸光光度 值，根据吸光光度值及标准曲线确定样品液浓度。
结果与分析
2 2． 1 多糖 HPL C 分析 从图 1 可知，多糖水解物中有 10 种，通过与标准品比对后，判定 8 种单糖成分:
甘露糖(Man )、核糖 ( Ｒi b )、鼠李糖 ( Ｒham )、葡萄糖醛酸 ( G l cU A )、葡萄糖 ( G l c )、半乳糖 ( Gal )、木糖
(X y l )、阿拉伯糖(A ra )，平均质量百分比分别为:19． 6% ，1． 0% ，0． 9% ，2． 4% ，60． 1% ，7． 3% ，6． 1% ，2． 5% 。 2． 2 葡萄糖标准曲线 分别准确吸取 0． 2，0． 3，0． 4，0． 5，0． 6，0． 7 g ·L － 1 的葡萄糖标准液 0． 1 mL ，同 1． 2． 5． 2法操作。在 490 nm 处测定吸光光度值 A 。以葡萄糖标准品的质量(mg ) 为横坐标，吸光光度值 A 为纵坐标，制成葡萄糖标准曲线图(图 2)。结合标准曲线并计算相关系数( Ｒ = 0． 999 ) 和浓度范围，获得 回归方程 Y = 9． 18X － 0． 002 6，其中 X 为样品多糖质量(m g )，Y 为吸光度。最后所得中性多糖或酸性多糖 “0． 9”。中性多糖的含量测定
准确量取由 1． 2． 4 法制得的中性多糖(10 批)供试液 0． 1 m L ，按照 1． 2． 5 法 2． 3 进行分析，测定吸光度值 A ，并计算 10 批次样品的中性多糖的含量，连续测定 3 次。再根据 1． 2． 1 中获得 的口服液中粗多糖平均含量，计算中性多糖的质量百分比。从表 1 可知，该口服液的中性多糖占总多糖
的质量百分比为 54． 3% ～ 67． 8% ，口服液中性多糖含量比较稳定，
10 批次的平均值为(61． 31 ± 6． 46)% 。
热带生物学报2014年172
图2 葡萄糖标准曲线
F i g． 2
宋逸婷G l uc o s e standard c urve
图1 口服液多糖水解糖PM P 衍生化HPLC 图谱
F i g．1M o n o sac char i de c o mp o s i t i o n of p o l ysacc har i des i n
Ch i nes e herb c o nc ent rates
表1 中草药口服液中性多糖的含量
T ab．1Contents of neutra l p o l ys acc har i des i n Ch i nes e herb c o nc ent rates
w(中性多糖)/ %
Neutra l p o l y sac char i des
批次号
Batch
A 490
1
2
3
4
5
6
7
8
生态学杂志9
10
0．219
0． 274
0．251
0． 254
0． 236
0． 259
0． 234
0． 262
0． 237
0． 249
54． 3
67． 8
62． 2
62． 9
58． 5
半月刊64．1
58． 0
64． 9
58． 7
61． 7
2． 4 酸性多糖的含量测定分别准确量取由1．2． 4 法制得的酸性多糖供试液(10 批)0．1m L，按照1．2． 5法进行分析，测定吸光度值，并计算10 批次样品的酸性多糖的质量百分比，连续测定 3 次。再根据1．2．1中获得的口服液粗多糖平均含量，计算酸性多糖的质量百分比。从表 2 可知，酸性多糖占总多糖的质量百分比为5． 9% ～11．8% ，口服液的酸性多糖含量相对比较稳定，10批次的平均值为(8．58 ±2．08)% 。
表2 中草药口服液酸性多糖的含量
T ab． 2 Contents of ac i d i c p o l ys acc har i des i n C h i nes e herb c o ncentrates
w(酸性多糖)/ %
A c i d i c p o l y sac char i de
批次号
如何上好体育课Batch
A 490
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5
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7
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9
10
0．219
0． 274
0．251
0． 254
0． 236
0． 259
0． 234
0． 262
0． 237
0． 249
8． 9
10．
1
9． 8
5． 5
9． 3
11．
8
9． 2
5． 9
有奖发票
第2 期秦垂新等：中药口服液中性、酸性多糖的检测方法173
3讨论
从口服液提取粗多糖后，依次经过酶解、脱蛋白、脱、醇沉等纯化制备步骤，粗多糖再经酸水解、PMP
柱前衍生化后通过反向液相谱的方法测定其单糖组成，根据对照品，可知口服液复合多糖主要由8 种单糖组成，包括甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖，其质量百分比为
m甘露糖∶ m核糖∶m鼠李糖∶ m葡萄糖醛酸∶m葡萄糖∶m半乳糖∶m木糖∶m阿拉伯糖= 19． 9∶0． 9 ∶ 0． 9 ∶2． 6 ∶61． 0 ∶7． 4 ∶5． 2 ∶2．1，其中葡萄糖占多数(61% )，而葡萄糖醛酸仅为2．6% 。利用十六烷基三甲基溴化铵(C TAB)可选择性与酸性多糖形成沉淀，从而分离酸性和中性多糖。再利用硫酸－苯酚法分别测定酸性和中性多糖的含量。测定结果表明，该中草药口服液的中性多糖和酸性多糖占总多糖的质量百分比分别为54． 3% ～67． 8% 和5． 9% ～11．8% 。笔者建立的酸性多糖和中性多糖的检测方法快捷可靠，干扰误差小，测定结果准确，可以为复合多糖分类检测提供参考，同时，在此基础上可以进一步研究中药口服液酸性多糖的结构及其生物活性。
参考文献:
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D e t e c t i on of Acidic and N e u t r al P ol ysacc har i d es
in Ch i n ese H e r b C onc e n t r at es
Q I N Chuixi n，CAO Z i f eng，TA NＲi r ong，L I N W ei bi n
(I nf i ni tus(China) Company L td．，J i angmen529156，C hi na)
Ab s t ract: Neutral and acidic polys acchar i des were separated and prepared from Chinese herbal concentrates u-
s i ng the CTAB precipitat i on method and were then analyzed quant i tat i v ely． The results show that the m onos ac- char i de c om pos i t i on of the polysacc har i des i n the Chinese herb concentrates are m annos e，r i bos e，rhamnos e，glucuronic acid，gal actos e，xylos e，arabinose w i th molar percentages of 19．6，1．0，0．9，2．4，60．1，7．3，6．1 and 2． 5 respect i v ely．Deter m i ned by us i ng the phenol-s ulfur i c acid m et hod the neutral polys acchar i des var i ed from 54． 3% to 67．8% of t he t o ta l p o l ysacchar i d e s，and the ac i d p o l ysacc har i d e s d i d from 5．9% ～11．8% ．This detect i on m et hod can be used as a referenc e for rapid cl ass i f i cat i on of polys acchar i des．
Key word s: acidic polysacc har i de; neutral polys acchar i des; Chinese herb; phenol-s ul fur i c acid method; C TAB
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站长QQ:729038198
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